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产品分类
 
·PCR
 
 





基因定点突变试剂盒
 产品货号: RF301
 产品名称: 基因定点突变试剂盒
 产品价格/规格: 5次/20次 0元/1000元
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 更新时间: 2018-07-18
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  • Site-directed Gene Mutagenesis Kit


     
                         基因定点突变试剂盒
    一、产品简介:

    本产品采用高保真的pfu酶,通过反向PCR法(Inverse PCR)进行定点突变。以环状DNA(如质粒)为模板,以反方向设计的两条引物对质粒进行完整的PCRpfu DNA聚合酶合成突变链;随后使用GM酶消化PCR产物,降解非突变型质粒模板(甲基化质粒模板),随后进行转化感受态细胞,有效地筛选出突变克隆(图一)。


    本产品特征:

    1. 采用部分重叠引物设计(图二),使PCR呈指数扩增,扩增产物凝胶电泳可见;扩增产物为环状,易于转化。

    2. 突变的真实性:可以得到高达95%的突变体。而且,由于采用pfu 高保真聚合酶,PCR过程中的第二位点突变(目标突变以外的突变)的可能性极小。

    二、保存条件:

    -20保存,有效期一年

    三、产品组成:

     

    内容

    RTF3101-015次)

    RTF3101-0220次)

    pfu DNA 聚合酶(2.5 U/μl

    20 U

    100 U

    2×pfu PCR buffer(含Mg2+

    0.1 ml

    0.5 ml

    10mM dNTP

    15 μl

    50 μl

    GM酶(5 U/μl

    6 μl

    22 μl

    pTGWB(Control plasmid,10ng/μl)

    5 μl

    25 μl

    Control Primer(RV+FW,5 μM each)

    5 μl

    25 μl

    DH5α化学感受态细胞(100μl/支)

    5

    20

    Water(RNase-free,DNase-free)

    1ml

    1ml


    四、使用说明

    1. 引物设计(图二)

    (1) 共需设计两条部分序列重叠的引物。引物包含5' 端重叠区和3' 端延伸区。

    (2) 引物长度:两条引物的长度大约30-45个核苷酸,5' 端重叠区包含15-20个碱基,3' 端延伸区包含至少10个碱基。

    (3) 突变引物:突变点位于两条引物上;正向引物的突变点位于重叠区下游,紧邻重叠区;反向引物的突变点位于5' 端。

    (4) 引物GC含量:在可能的情况下,尽量把引物的GC含量控制在40-60%。

    (5) 在可能的情况下,尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体可以通过一些软件进行分析,如Oligo

    (6) 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。

    2. 待突变模板质粒的选择:

    必需使用从dam的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变,如DH5αJM109等。

    选择GC含量在40-55%的待突变模板质粒,并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果GC含量过高,请先把目的基因克隆到其它合适的载体上,再进行基因定点突变反应。另外目的基因GC含量最好也在40-55%的范围,并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果目的基因GC含量过高,而突变位点不在高GC含量区域,可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来,进行定点突变,然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的质粒模板,或者有局部高GC含量的质粒模板,请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。

    3. 对照质粒:

    本试剂盒中含有对照质粒(pTGWB),其LacZ基因已经突变,第6个氨基酸密码子突变为TAA(终止密码子)(图三)。当被转化入大肠杆菌后,在X-Gal板上形成白色菌落。利用试剂盒添附的对照引物进行突变反应后,该密码子可从TAA(终止密码子)恢复为CCAPro),转化后可在X-Gal板上产生蓝色菌落,这样就可以简单地确认突变反应是否正确进行。根据本实验操作步骤进行该突变反应,通常可获得80%以上的蓝色菌落。



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