DNA非变性PAGE电泳试剂盒(货号RTE4101) Ver.690775
DNA Native PAGE
Electrophoresis Kit
● 产品组成:
货号
|
名称
|
规格
|
保存条件
|
AC2913-02
|
30%PAA(29:1)
|
500 ml
|
4℃
|
TB001
|
5×TBE
|
500 ml
|
RT
|
AP020P
|
APS(干粉)
|
0.5 g
|
RT(配制后-20℃贮存)
|
TA0761-01
|
TEMED
|
0.5 ml
|
4℃,避光
|
DL070
|
6×Native-PAGE DNA上样缓冲液
|
1 ml
|
4℃
|
● 产品简介:
非变性 PAGE 电泳是研究DNA构象变化的常用手段,在非变性条件下DNA的泳动与电荷、片段大小、DNA结合的蛋白及折叠构象都有关系。非变性PAGE电泳是研究单链 PCR片段构象多态性(SSCP-PCR,single-strand conformation
polymorphism-PCR)的重要研究手段。在SSCP测定中,双链DNA(dsDNA)变性为单链DNA(ssDNA),每一条单链DNA都基于他们的内部序列呈现不同的折叠构象,即使相同长度的单链DNA因其碱基顺序不同,甚至单个碱基的不同都会形成不同的构象。这些不同构象的ssDNA 在非变性PAGE中得到分离。
本公司提供的DNA非变性PAGE电泳试剂盒包含凝胶制备及电泳所需的全部试剂,用户只需自备制胶器具和蒸馏水,即可配制各种浓度的PAGE胶,使用方便。
按照每次制备100 ml 12%凝胶计算,试剂盒可配制10-12块非变性PAGE胶;按照每次制备8 ml 12%凝胶计算,试剂盒可配制至少100块非变性PAGE胶。
● 贮存和效期:
本产品常温运输,按照标签温度贮存;有效期一年。
● 使用说明:
一、制备凝胶步骤:
10% APS配制-5 ml:
将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中,彻底溶解后分装,1 ml/支,-20℃备存,每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间,以防失效。10%APS在4℃有效期为一周,-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换使用-20度保存的10% APS。
1.参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。
2.根据表一和表二,将不同体积的成分在适当容器中混合。
表一 配制不同浓度凝胶所需各组分的体积(总体积100 ml,适用于大板胶)
|
|
各组份体积(ml)
|
|
最佳DNA分离范围
|
凝胶浓度
|
灭菌水
|
30%PAA(29:1)
|
5×TBE
|
10%APS
|
TEMED
|
总体积
|
80-500 bp
|
5%
|
63.3
|
16.7
|
20
|
0.8-1
|
0.1
|
100 ml
|
70-450 bp
|
6%
|
60
|
20
|
20
|
0.8-1
|
0.1
|
100 ml
|
60-460 bp
|
8%
|
53.3
|
26.7
|
20
|
0.8-1
|
0.1
|
100 ml
|
50-300 bp
|
10%
|
46.7
|
33.3
|
20
|
0.5-0.8
|
0.1
|
100 ml
|
40-200 bp
|
12%
|
40
|
40
|
20
|
0.5-0.8
|
0.1
|
100 ml
|
25-150 bp
|
15%
|
30
|
50
|
20
|
0.5
|
0.1
|
100 ml
|
5-100 bp
|
20%
|
13.3
|
66.7
|
20
|
0.5
|
0.1
|
100 ml
|
表二 配制不同浓度凝胶所需各组分的体积(总体积8 ml,适用于小板胶)
|
|
各组份体积(ml)
|
|
最佳DNA分离范围
|
凝胶浓度
|
灭菌水
|
30%PAA(29:1)
|
5×TBE
|
10%APS
|
TEMED
|
总体积
|
80-500 bp
|
5%
|
5.07
|
1.33
|
1.6
|
0.08
|
0.008
|
8 ml
|
70-450 bp
|
6%
|
4.8
|
1.6
|
1.6
|
0.08
|
0.008
|
8 ml
|
60-460 bp
|
8%
|
4.27
|
2.13
|
1.6
|
0.08
|
0.008
|
8 ml
|
50-300 bp
|
10%
|
3.73
|
2.67
|
1.6
|
0.08
|
0.008
|
8 ml
|
40-200 bp
|
12%
|
3.2
|
3.2
|
1.6
|
0.05
|
0.008
|
8 ml
|
25-150 bp
|
15%
|
2.4
|
4
|
1.6
|
0.05
|
0.008
|
8 ml
|
5-100 bp
|
20%
|
1.07
|
5.33
|
1.6
|
0.05
|
0.008
|
8 ml
|
注: = 1 \* GB3 ① 有大量文献报道PAGE胶中加入5%-10%的甘油能提高某些位点的分辨率。如果选择加入10%的甘油,则相应减少去离子水的用量。
= 2 \* GB3 ② 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
3.在凝胶模具中灌入适量凝胶溶液,在胶的液面距离达到顶部时停止灌胶,插入梳子。
4.常温静置30-60分钟,
注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
5. 拔出梳子,用1×TBE液冲洗加样孔。
6.4℃冰箱预冷30分钟或过夜预冷。为了防止胶收缩,最好顶部加少量1×TBE缓冲液。预冷的胶有利于保持单链DNA的构型。
二、电泳:
7. 将预冷的凝胶板固定在电泳装置上,往上槽和下槽中加入足够1×TBE电泳液。
8. 取 5-10 μl
SSCP-PCR样品,加入相应体积6×Native PAGE DNA上样液,85℃5分钟后冰浴,短暂离心后取2-5 μl上样。
9. 连接电源线,打开电源开关。按照5V/cm 电压电泳。由于温度变化过大会改变 DNA 构型,所以电泳时最好能保持恒温。对不含甘油的PAGE,最好恒温在4℃,对含甘油的PAGE,最好恒温在25℃。
10. 终止电泳,取出凝胶进行后续的处理(如银染)(核酸快速银染试剂盒 Cat RTS5101) 。
● 常见问题:
1. 为何 SSCP-PCR带型有复合条带?
原因之一:可能是残留的 PCR 引物跟单链的 DNA 结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
原因之二:可能是PCR产物用量过高,彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4-8倍后使用。
2. 如何提高电泳分辨率?
可以在配胶时加入甘油(终浓度为5%-10%),因为甘油是弱变性剂,能部分展开 DNA 折叠结构,增加表面积,增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大,电泳速度变慢,因此只适合常温电泳使用,不要4℃电泳。如果条件允许,最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。
实验示例