免费咨询电话: 400-699-0631      点击这里给我发消息
 
 
 
产品分类
 
·PCR
 
 





RTE4101 DNA非变性PAGE电泳试剂盒
 产品货号: RTE4101
 产品名称: RTE4101 DNA非变性PAGE电泳试剂盒
 产品价格/规格: 45板 0.75mm胶 450元
 产品说明书: 点击查看
 更新时间: 2021-05-22
详细信息   访问次数:

  • 产品介绍
  • 发表文章
  • 相关产品
  •  TBE-PAGE电泳可以选择RTM441 20bp DNA ladder作为分子量标准。                    


     

                             DNA非变性PAGE电泳试剂盒(货号RTE4101  

                           DNA Native PAGE Electrophoresis Kit

    产品组成:

    货号

    名称

    规格

    保存条件

    AC2913-01

    30%PAA(29:1)

    100 ml

    4

    TB001

    5×TBE

    500 ml

    RT

    AP020P

    APS(干粉)

    5 ml

    RT配制后-20贮存

    TA0761-01

    TEMED

    0.5 ml

    4,避光

    DL070

    6×Native-PAGE DNA上样缓冲液

    1 ml

    4

    产品简介:

    非变性 PAGE 电泳是研究DNA构象变化的常用手段,在非变性条件下DNA的泳动与电荷、片段大小、DNA结合的蛋白及折叠构象都有关系。非变性PAGE电泳是研究单链 PCR片段构象多态性(SSCP-PCR,single-strand conformation  polymorphism-PCR)的重要研究手段。在SSCP测定中,双链DNA(dsDNA)变性为单链DNA(ssDNA),每一条单链DNA都基于他们的内部序列呈现不同的折叠构象,即使相同长度的单链DNA因其碱基顺序不同,甚至单个碱基的不同都会形成不同的构象。这些不同构象的ssDNA 在非变性PAGE中得到分离。另外,非变性PAGE还可以分离小片段的双链DNA,与琼脂糖电泳相比,对低于500bp的双链DNA片段有更优秀的分辨率。

    本公司提供的DNA非变性PAGE电泳试剂盒包含凝胶制备及电泳所需的全部试剂,用户只需自备制胶器具和蒸馏水,即可配制各种浓度的PAGE胶,使用方便。

    本试剂盒大约可以配制20-45块常规大小(8×10cm)PAGE凝胶,具体数量根据凝胶厚度决定:0.75mm厚度凝胶可以配制45块胶,1mm厚度凝胶可以配制至少35块胶,1.5mm厚度凝胶可以配制至少20块胶。

    贮存和效期:

       本产品常温运输,按照标签温度贮存;有效期一年。

    使用说明:

    10% APS配制-5 ml

    将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中,彻底溶解后分装,1 ml/支,-20℃备存,每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间,以防失效。10%APS在4℃有效期为一周,-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换使用-20度保存的10% APS。

    一、制备凝胶步骤:(以下步骤为制备8×10cm厚度1.0mm胶)

    1.1 参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。

    1.2按照表一将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合;最后加入10%APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。

    1.3在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于mini-gel,凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可),然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5 cm的水层,使凝胶表面保持平整。

    1.4静置10-20分钟,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后,说明凝胶已聚合

    表一 TBE-PAGE分离胶配方表 (总体积5 ml,适用于厚度1.0 mm小板胶)

    各组份体积(ml

    最佳DNA分离范围

    凝胶浓度

    灭菌水

    30%PAA291

    5×TBE

    10%APS

    TEMED

    70-450 bp

    6%

    3

    1.0

    1.0

    0.05

    0.005

    60-460 bp

    8%

    2.66

    1.34

    1.0

    0.05

    0.005

    50-300 bp

    10%

    2.33

    1.67

    1.0

    0.05

    0.005

    40-200 bp

    12%

    2

    2.0

    1.0

    0.05

    0.005

    25-150 bp

    15%

    0.5

    2.5

    1.0

    0.05

    0.005

    5-100 bp

    20%

    0.66

    3.34

    1.0

    0.05

    0.005

    注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

    1.5去除覆盖在分离胶上的水层;按照表二将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合;最后加入10%过硫酸铵和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。

    表二 TBE-PAGE 4%浓缩配方表 (总体积1.5 ml,适用于1.0mm厚度胶)

    各组份体积(ml

    凝胶浓度

    灭菌水

    30%PAA291

    5×TBE

    10%APS

    TEMED

    4%

    1.0

    0.2

    0.3

    0.02

    0.002

    1.6将浓缩胶溶液加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端;将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。

    1.7静置30-60分钟,等待浓缩胶聚合。

    注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

    二、电泳:

    2.1 1×TBE电泳液配制:取100ml 5×TBE,加蒸馏水400 ml,即配成500 ml 1×TBE。将凝胶板固定在电泳装置上,往上槽和下槽中加入足够1×TBE电泳液。 用1ml吸头冲洗加样孔1-2次。

    2.2 取待测样品,加入相应体积6×Native PAGE DNA上样液,如5 μl样品加1 μl 上样液,短暂离

    心后取5-10 μl上样。TBE-PAGE中判断双链DNA大小可以选择20bp DNA ladder(货号:RTM441)作为DNA Marker。

    2.3 连接电源线,打开电源开关。200 V稳压电泳。至二甲苯菁指示前沿到达凝胶三分之二位置时结束电泳。

    TBE-PAGE电泳

    恒电压

    起始电流

    结束电流

    电泳时间

    200 V

    20-25 mA/板胶

    10-15 mA/板胶

    70+min

    三、染色:

    3.1 漂洗:玻璃板上拆下凝胶后,适量蒸馏水漂洗3-5分钟。

    3.2 染色液配制:

      TBE-PAGE胶可以使用EBRealSafe类染料后染染色,以下程序用RealSafe Red核酸染料进行染色。即用型染色液配制:

     

    即用型RealSafe核酸染色液

     

    100 ml

    1×TBE

    100 ml

    RealSafe Red核酸染料

    20 μl

    3.3染色:

      凝胶浸泡于即用型染色液中,常温避光摇床40-60rpm染色30 分钟。


    五、常见问题:

    1. 为何 SSCP-PCR带型有复合条带?

    原因之一:可能是残留的 PCR 引物跟单链的 DNA 结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。

    原因之二:可能是PCR产物用量过高,彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4-8倍后使用。 

    2. 如何提高电泳分辨率?

    可以在配胶时加入甘油(终浓度为5%-10%),因为甘油是弱变性剂,能部分展开 DNA 折叠结构,增加表面积,增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大,电泳速度变慢,因此只适合常温电泳使用,不要4℃电泳。如果条件允许,最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。


    实验示例




TOP】【打印本页】【关闭窗口



中科瑞泰(北京)生物科技有限公司 版权所有 京ICP备12052607 网站管理   快递查询   IF查询
电话:010-58437227 免费电话:400-699-0631 传真:010-57909566
点击这里给我发消息   内勤订货QQ:2446698252   技术支持QQ:460449375 电子邮箱:real-times@vip.163.com
注意:公司所有产品仅供科研使用
_×
在线咨询