DNA非变性PAGE电泳试剂盒（货号RTE4101） Ver.690775
DNA Native PAGE
Electrophoresis Kit
● 产品组成：
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货号
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名称
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规格
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保存条件
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AC2913-02
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30%PAA(29:1)
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500 ml
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4℃
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TB001
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5×TBE
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500 ml
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RT
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AP020P
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APS（干粉）
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0.5 g
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RT（配制后-20℃贮存）
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TA0761-01
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光
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DL070
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6×Native-PAGE DNA上样缓冲液
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1 ml
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4℃
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● 产品简介：
非变性 PAGE 电泳是研究DNA构象变化的常用手段，在非变性条件下DNA的泳动与电荷、片段大小、DNA结合的蛋白及折叠构象都有关系。非变性PAGE电泳是研究单链 PCR片段构象多态性（SSCP-PCR，single-strand conformation
polymorphism-PCR）的重要研究手段。在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于他们的内部序列呈现不同的折叠构象，即使相同长度的单链DNA因其碱基顺序不同，甚至单个碱基的不同都会形成不同的构象。这些不同构象的ssDNA 在非变性PAGE中得到分离。
本公司提供的DNA非变性PAGE电泳试剂盒包含凝胶制备及电泳所需的全部试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水，即可配制各种浓度的PAGE胶，使用方便。
按照每次制备100 ml 12%凝胶计算，试剂盒可配制10-12块非变性PAGE胶；按照每次制备8 ml 12%凝胶计算，试剂盒可配制至少100块非变性PAGE胶。
● 贮存和效期：
本产品常温运输，按照标签温度贮存；有效期一年。
● 使用说明：
一、制备凝胶步骤：
10% APS配制-5 ml：
将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中，彻底溶解后分装，1 ml/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10% APS。
1．参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
2．根据表一和表二，将不同体积的成分在适当容器中混合。
表一 配制不同浓度凝胶所需各组分的体积(总体积100 ml，适用于大板胶)
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各组份体积（ml）
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最佳DNA分离范围
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凝胶浓度
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灭菌水
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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总体积
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80-500 bp
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5%
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63.3
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16.7
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20
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0.8-1
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0.1
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100 ml
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70-450 bp
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6%
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60
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20
|
20
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0.8-1
|
0.1
|
100 ml
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|
60-460 bp
|
8%
|
53.3
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26.7
|
20
|
0.8-1
|
0.1
|
100 ml
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50-300 bp
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10%
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46.7
|
33.3
|
20
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0.5-0.8
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0.1
|
100 ml
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40-200 bp
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12%
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40
|
40
|
20
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0.5-0.8
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0.1
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100 ml
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25-150 bp
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15%
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30
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50
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20
|
0.5
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0.1
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100 ml
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5-100 bp
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20%
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13.3
|
66.7
|
20
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0.5
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0.1
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100 ml
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表二 配制不同浓度凝胶所需各组分的体积(总体积8 ml，适用于小板胶)
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各组份体积（ml）
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最佳DNA分离范围
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凝胶浓度
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灭菌水
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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总体积
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80-500 bp
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5%
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5.07
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1.33
|
1.6
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0.08
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0.008
|
8 ml
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70-450 bp
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6%
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4.8
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1.6
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1.6
|
0.08
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0.008
|
8 ml
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60-460 bp
|
8%
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4.27
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2.13
|
1.6
|
0.08
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0.008
|
8 ml
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50-300 bp
|
10%
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3.73
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2.67
|
1.6
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0.08
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0.008
|
8 ml
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40-200 bp
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12%
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3.2
|
3.2
|
1.6
|
0.05
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0.008
|
8 ml
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25-150 bp
|
15%
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2.4
|
4
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1.6
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0.05
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0.008
|
8 ml
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5-100 bp
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20%
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1.07
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5.33
|
1.6
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0.05
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0.008
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8 ml
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注： = 1 \* GB3 ① 有大量文献报道PAGE胶中加入5%-10%的甘油能提高某些位点的分辨率。如果选择加入10%的甘油，则相应减少去离子水的用量。
= 2 \* GB3 ② 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
3．在凝胶模具中灌入适量凝胶溶液，在胶的液面距离达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
4．常温静置30-60分钟，
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
5. 拔出梳子，用1×TBE液冲洗加样孔。
6.4℃冰箱预冷30分钟或过夜预冷。为了防止胶收缩，最好顶部加少量1×TBE缓冲液。预冷的胶有利于保持单链DNA的构型。
二、电泳：
7. 将预冷的凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够1×TBE电泳液。
8. 取 5-10 μl
SSCP-PCR样品，加入相应体积6×Native PAGE DNA上样液，85℃5分钟后冰浴，短暂离心后取2-5 μl上样。
9. 连接电源线，打开电源开关。按照5V/cm 电压电泳。由于温度变化过大会改变 DNA 构型，所以电泳时最好能保持恒温。对不含甘油的PAGE，最好恒温在4℃，对含甘油的PAGE，最好恒温在25℃。
10. 终止电泳，取出凝胶进行后续的处理（如银染）（核酸快速银染试剂盒 Cat RTS5101） 。
● 常见问题：
1. 为何 SSCP-PCR带型有复合条带？
原因之一：可能是残留的 PCR 引物跟单链的 DNA 结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
原因之二：可能是PCR产物用量过高，彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4-8倍后使用。
2. 如何提高电泳分辨率？
可以在配胶时加入甘油（终浓度为5%-10%），因为甘油是弱变性剂，能部分展开 DNA 折叠结构，增加表面积，增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大，电泳速度变慢，因此只适合常温电泳使用，不要4℃电泳。如果条件允许，最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。
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