TBE-PAGE电泳可以选择RTM441 20bp DNA ladder作为分子量标准。                    

                         DNA非变性PAGE电泳试剂盒（货号RTE4101）  

                       DNA Native PAGE Electrophoresis Kit

● 产品组成：

● 产品简介：

非变性 PAGE 电泳是研究DNA构象变化的常用手段，在非变性条件下DNA的泳动与电荷、片段大小、DNA结合的蛋白及折叠构象都有关系。非变性PAGE电泳是研究单链 PCR片段构象多态性（SSCP-PCR，single-strand conformation  polymorphism-PCR）的重要研究手段。在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于他们的内部序列呈现不同的折叠构象，即使相同长度的单链DNA因其碱基顺序不同，甚至单个碱基的不同都会形成不同的构象。这些不同构象的ssDNA 在非变性PAGE中得到分离。另外，非变性PAGE还可以分离小片段的双链DNA，与琼脂糖电泳相比，对低于500bp的双链DNA片段有更优秀的分辨率。

本公司提供的DNA非变性PAGE电泳试剂盒包含凝胶制备及电泳所需的全部试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水，即可配制各种浓度的PAGE胶，使用方便。

本试剂盒大约可以配制20-45块常规大小（8×10cm）PAGE凝胶，具体数量根据凝胶厚度决定：0.75mm厚度凝胶可以配制45块胶，1mm厚度凝胶可以配制至少35块胶，1.5mm厚度凝胶可以配制至少20块胶。

● 贮存和效期：

   本产品常温运输，按照标签温度贮存；有效期一年。

● 使用说明：

10% APS配制-5 ml：

将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中，彻底溶解后分装，1 ml/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10% APS。

一、制备凝胶步骤：（以下步骤为制备8×10cm厚度1.0mm胶）

1.1 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。

1.2按照表一将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合；最后加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

1.3在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5 cm的水层，使凝胶表面保持平整。

1.4静置10-20分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合

表一 TBE-PAGE分离胶配方表 (总体积5 ml，适用于厚度1.0 mm小板胶)

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

1.5去除覆盖在分离胶上的水层；按照表二将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

表二 TBE-PAGE 4%浓缩配方表 (总体积1.5 ml，适用于1.0mm厚度胶)

1.6将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

1.7静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

二、电泳：

2.1 1×TBE电泳液配制：取100ml 5×TBE，加蒸馏水400 ml，即配成500 ml 1×TBE。将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够1×TBE电泳液。 用1ml吸头冲洗加样孔1-2次。

2.2 取待测样品，加入相应体积6×Native PAGE DNA上样液，如5 μl样品加1 μl 上样液，短暂离

心后取5-10 μl上样。TBE-PAGE中判断双链DNA大小可以选择20bp DNA ladder（货号：RTM441）作为DNA Marker。

2.3 连接电源线，打开电源开关。200 V稳压电泳。至二甲苯菁指示前沿到达凝胶三分之二位置时结束电泳。

三、染色：

3.1 漂洗：玻璃板上拆下凝胶后，适量蒸馏水漂洗3-5分钟。

3.2 染色液配制：

  TBE-PAGE胶可以使用EB或RealSafe类染料后染染色，以下程序用RealSafe Red核酸染料进行染色。即用型染色液配制：

3.3染色：

五、常见问题：

1. 为何 SSCP-PCR带型有复合条带？

原因之一：可能是残留的 PCR 引物跟单链的 DNA 结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。

原因之二：可能是PCR产物用量过高，彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4-8倍后使用。 

2. 如何提高电泳分辨率？

实验示例