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·PCR
 
 
 





pfu DNA聚合酶
 产品货号: RTH3102
 产品名称: pfu DNA聚合酶
 产品价格/规格: 100U/5×100U
 产品说明书: 点击查看
 更新时间: 2018-02-02
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  • pfu DNA Polymerase

    高保真平末端DNA聚合酶

    目录号

    浓度

    包装

    价格

    RTH3102-02

    2.5 U/μl

    100 U 40μl

    100

    RTH3102-03

    2.5 U/μl

    5×100 U5×40μl

    450

    贮存

       -20保存一年。

    产品简介

    pfu DNA Polymerase是嗜热古细菌来源的DNA聚合酶,该酶除具有5’-3’DNA聚合酶活性外,还具有很强的3’-5’外切酶活性,增强了PCR扩增的保真度。与Taq酶相比,pfu聚合酶热稳定性更好,更能忍耐较高的变性温度。Pfu的保真性是Taq DNA聚合酶的10-15倍。延伸速度为0.5kb/分钟。PCR产物3’端不带碱基A,为平滑末端,要通过平滑末端克隆法进行克隆。

    产品组成(RTH3102-02

    pfu DNA Polymerase2.5U/μl            40μl

    10×pfu PCR buffer(含Mg2             1ml

    活性定义

    1单位(U) pfu DNA Polymerase活力定义为在7430分钟内,以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸不溶物质所需的酶量。

    酶贮存缓冲液

    50 mM Tris-HCl (pH 8.0); 0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 50 mM KCl ; Stabilizers; 50% glycerol

    适用范围

    高保真的DNA片段的扩增、DNA片段的平滑化。

    使用说明:

    1. 按照下表在0.2ml PCR管中制备反应体系:

    成分

    20μl反应体系

    50μl反应体系

    终浓度

    Template

    0.04-0.2 μg

    0.1-0.5 μg

    as you wish

    Primer 110 μM

    0.4 μl

    1 μl

    0.2 μM

    Primer 210μM

    0.4 μl

    1 μl

    0.2 μM

    10×pfu PCR buffer(Mg2+)

    2 μl

    5 μl

    dNTP Mixture(10 mM)

    0.4 μl

    1 μl

    200 μM each

    pfu (2.5 U/μl)

    0.4 μl

    1 μl

    0.05U/μl

    ddH2O

    up to 20 μl

    up to 50 μl

    -

    1:如果需要改变Mg2+浓度,根据下表调节

    PCR反应体系中Mg2+终浓度

    2 mM

    2.5 mM

    3 mM

    4 mM

    20μl反应体系中25 mM MgSO4加入量

    0 μl

    0.4 μl

    0.8 μl

    1.6 μl

    50μl反应体系中25 mM MgSO4加入量

    0 μl

    1 μl

    2 μl

    4 μl

    2:配制反应液时,请最后加入pfu,因为本酶有很强的3’-5’外切酶活性,有可能降解引物。

     

    2. 混匀后,离心快甩将反应液收集到管底。

    3. PCR仪如果没有热盖加热的话,补加25μl矿物油。

    4. PCR仪上执行以下程序:

    步骤

    温度

    时间

    循环数

    初始变性

    94

    3-5 min

    1

    变性

    94

    30 sec

    25-40*

    退火

    50-60*

    30 sec

    延伸

    72

    0.5kb/min*

    最后延伸

    72

    5 min

    1

     

    *注: PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异。在实际操作中需根据模板、目的片段的大小、碱基序列和引物的长短等具体情况,设定最佳的反应条件(温度、时间等)。

    ● 注意事项

    1. pfu 酶具有 3-5的外切酶活性,所以 pfu 酶扩增时延伸速度远比 Taq 酶低,应根据扩增产物的长度设置相应的延伸时间,一般情况下 pfu 酶的延伸速度为每分钟 0.5kb;同时 pfu 酶的 3-5的外切酶活性可能降解引物,所以应最后把pfu 酶到反应体系中,并立即进行 PCR 反应。

    2. pfu 酶的热稳定性比 Taq 酶好,对于 GC 含量很高的模板,变性温度可以提高到98,对 pfu 酶的活性无影响。

    使用举例:

    水稻基因组做模板



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