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产品分类
 
·PCR
 
 





2×SYBR qPCR MasterMix
 产品货号: RTQ3101
 产品名称: 2×SYBR qPCR MasterMix
 产品价格/规格: 1ml/5×1ml/20×1ml 300元/1200元/4000元
 产品说明书: 点击查看
 更新时间: 2018-08-27
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  •  2×SYBR qPCR MasterMix         

    产品包装:

     

    组成

    RTQ3101-02

    (可做4050 μl反应)

    RTQ3101-03

    (可做20050 μl反应)

    RTQ3101-04

    (可做80050 μl反应)

    长期贮存

    2×SYBR qPCR MasterMix

    1ml

    5×1ml

    20×1ml

    -20

     

    组成

    RTQ3101R1-02

    (可做4050 μl反应)

    RTQ3101R2-03

    (可做20050 μl反应)

    RTQ3101R2-04

    (可做80050 μl反应)

    长期贮存

    2×SYBR qPCR MasterMix

    1ml

    5×1ml

    20×1ml

    -20

    ROX Solution I (50×)

    20 μl

    100 μl

    4×100 μl

    -20

     

    组成

    RTQ3101R2-02

    (可做4050 μl反应)

    RTQ3101R2-03

    (可做20050 μl反应)

    RTQ3101R2-04

    (可做80050 μl反应)

    长期贮存

    2×SYBR qPCR MasterMix

    1ml

    5×1ml

    20×1ml

    -20

    ROX Solution II (50×)

    20 μl

    100 μl

    4×100 μl

    -20















    注:以50μl qPCR反应体系为例,每次使用25μl 2×MasterMix1ml可做40 50μl qPCR反应。

    储存条件: -20℃保存至少6个月;经常使用时,一旦融化后请4℃贮存,4℃保存至少3个月;尽量避免反复冻融。

    产品简介:

    本制品是采用SYBR® Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。已经将 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液和 SYBR® Green I 等试剂预混成一种适合 Real Time PCR反应检测用 2×MasterMix试剂,具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板、引物和水,便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对目的基因进行准确定量检测,重复性好,可信度高。

    注意事项

    1. 本制品中不含内参染料ROX,ROX染料单独供应。客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX内参染料,用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

    仪器型号

    ROX Solution I

    50μl反应体系加入量

    ROX Solution II

    50μl反应体系加入量

    ABI:7300,7900HT,StepOneTM,StepOnePlusTM,ABI PRISM7000 and 7700

    1 μl

    -

    ABI:7500,Stratagene:Mx3000PTM,Mx3005PTM,Mx4000

    -

    1 μl

    Bio-Rad: iCycler® iQ, iQ5 and MyiQ™, Opticon®, CFX 96, CFX 384

    Roche: LightCycler® 480, LightCycler® 2.0

    Eppendorf: MasterCycler™ ep realplex

    Corbett: Rotor-Gene™ 3000, 6000

    Cepheid: Smart Cycler®

    杭州博日

    不需要

    不需要

    2. 本制品含SYBR® Green I,强光下易分解,使用时避免长时间强光照射本制品。

    3. 建议在冰上配制qPCR反应液,再放入qPCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性,减少背景。

    4.-20℃下保存时间较长,有微量沉淀产生,充分混匀后不影响使用。本制品已经优化了反应缓冲液中的Mg2+浓度,无需再调节Mg2+浓度。

    5. 模板DNA:用本产品,cDNA、基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA等都可作为模板。在添加DNA模板时请注意模板量对PCR扩增的影响。本产品建议添加量为:cDNA添加量不应超过总反应体系的10%;基因组DNA为模板时,为避免在高浓度区域出现线性差的情况,请注意添加量小于500ng;病毒DNA也可作为PCR模板,添加时请以300ng为上限;由于质粒DNA浓度和拷贝数很高,在添加PCR模板之前最好进行稀释梯度试验,以便确定合适的质粒DNA拷贝数。

    6. 引物:

    建议每条引物工作浓度200 nM ~ 800 nM;为得到高灵敏度定量性的数据,引物的设计非常重要。以下列举了设计引物时需注意的一般事项。

    a) 引物长度请设定为18bp30bpGC含量为40%65%

    b) 扩增片段一般小于300bp,如可能请尽量设定在80bp150bp。过长的片段容易导致扩增效率降低;

    c) 如设计mRNA为目的片段的引物,设计应尽量横跨内含子,以防止基因组DNA的扩增而引起假阳性;

    d) 请尽量选择Tm65℃~67℃;

    e) AGCT整体分布尽量均匀。不要有部分的GC richAT rich(特别是3'端)。避开T/CPolypyrimidine)或A/GPolypurine)的连续结构;

    f) 避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。二条引物间的3'末端避开有2个碱基以上的互补序列;

    g) 引物设计完成后要使用BLAST检索确认引物的特异性。

    此外,引物的纯化纯度对反应特异性有很大的影响。经过一般纯化、纯度较低的引物荧光强度散乱,容易产生非特异性产物,致使熔解曲线出现杂峰。请尽可能使用HPLC级别纯化,至少要用经Cartridge(OPC)级别以上纯化的引物。

    7. 对照设计:

    1No template controlNTC):qPCR反应体系中仅仅缺少模板。用以检测有无二聚体和试剂有无污染。

    2Reverse Transcripase control用以评估逆转录反应中有无基因组DNA的污染。在逆转录反应中仅仅不含有逆转录酶。

    ●     使用说明:

    1. 冰浴中彻底融化2×qMasterMix,彻底混匀后快甩离心将溶液收集到管底。

    2. 按照下表在0.2ml PCR管中制备反应体系:

     

    50μl反应体系

    20μl反应体系

    终浓度

    2×qPCR MasterMix

    25 μl

    10 μl

    上游引物 10 μM

    1 μl

    0.4 μl

    0.2 μM

    下游引物 10 μM

    1 μl

    0.4 μl

    0.2 μM

    ROX Slolution I or II(50×)

    1 μl or 不加

    0.4 μl or 不加

    x

    模板

    × μl

    x μl

    10pg-100ng

    补至50 μl

    补至20 μl

     

    3. 快甩离心将反应液收集到管底。

    4. 检测片段大于300bp,qPCR仪上推荐执行以下程序(三步法):

    步骤

    温度

    时间

    循环数

    初始变性

    95

    10min*

    1

    变性

    95

    15 sec

    40

    退火

    55

    30 sec

    延伸

    72

    30sec

    检测片段小于300bp,qPCR仪上推荐执行以下程序(两步法):

    步骤

    温度

    时间

    循环数

    初始变性

    95

    10min*

    1

    变性

    95

    15 sec

    40

    退火和延伸

    60

    60 sec

    注:由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是经过化学修饰封闭的,初始变性95 10分钟是必须的,时间过短会降低酶的活性。

    实验结果分析

    反应结束后加做融解曲线,以区分扩增产物及引物二聚体。根据扩增曲线和融解解曲线结果可进行PCR定量标准曲线的制作。

    常见问题及处理

    问题

    可能原因

    推荐的解决方法

    无扩增曲线且无扩增产物(凝胶电泳)

    反应体系中有PCR反应抑制剂

    更换或纯化模板DNA

    引物设计不合理

    重新设计、合成引物。

    逆转录产物体积过量

    减少逆转录产物量以不超过反应体系的10%

    加样错误或有试剂未加

    检查是否加了所有的所需试剂。

    引物的降解

    通过PAGE电泳检测引物完整性。

    退火温度不正确

    优化退火温度。

    无扩增曲线但有扩增产物(凝胶电泳)

    qPCR仪设置不正确

    检查dye selctionreference dye是否选择正确

    失效的荧光检测

    荧光检测应在PCR循环的退火/延伸阶段。

    荧光PCR仪问题

    参考qPCR仪器说明书

    阴性对照(NTC)有扩增曲线

     

    反应体系中有污染

    qPCR片段较小,极易造成环境中气溶胶污染。如果融解曲线分析,解链温度和目的片段相同,凝胶电泳中NTC中的片段大小和目的片段相同,极有可能是反应体系中某一或某些试剂污染所引起的。建议换至没有污染源的环境进行PCR体系的配制。

    引物二聚体

    进行溶解曲线分析,如果扩增曲线的解链温度小于80,凝胶电泳片段大小和目的片度不符。请重新设计引物。

    提高退火温度3

    PCR效率高于110%

    (斜率>-3.1

    有非特异性扩增

    溶解曲线分析非特异性扩增;优化引物设计

    PCR扩增效率低于90%

    (斜率<-3.6)

    反应体系中有PCR反应抑制剂

    更换或纯化模板DNA

    PCR扩增条件不合适引起扩增效率降低。

    确认引物浓度。

    注意qPCR Master Mix是否失效。

    引物设计

    重新设计引物,避免扩增区域的DNA二级结构。

    实时荧光曲线线性不好

    模板DNA含量较低或过高

    应调整样品的DNA浓度。

    模板DNA中含有抑制PCR扩增反应的物质

    对模板DNA进行纯化或更换模板。

    质量不好的逆转录试剂盒合成的cDNA,逆转录反应液中所含的物质可能抑制PCR反应。

    请降低样品浓度,或将样品纯化后再进行反应。建议使用品牌质量较好的cDNA合成逆转录试剂盒。

    CT值高于预期值

    加入的模板量太少

    适当增加模板量。

    样品被降解

    检查样品的完整性。

    引物不合适

    重新设计合成引物。

    CT值低于预期值

    加入了过多的模板

    减少模板量。

    PCR产物太长

    一般采用100-150bp的产物长度,一般不超过500bp

    CT值的标准差>0.16

    取样不准确

    每种样品的反应混合液单独配制,充分混匀;

    qPCR之前要离心,管壁不要沾有反应液。

    ΔRn值太小

    PCR效率太低

    优化PCR反应条件。

    目标模板数太低

    增加模板量。

    扩增曲线的荧光信号弱,或扩增曲线呈锯齿状

     

    ROX添加量太大

    使请根据ROX使用方法和使用的PCR仪进行确定ROX的添加量。

    荧光校正错误

    请联系PCR仪器工程师或参照PCR仪器的使用说明书,进行本底和荧光校正。

    PCR的延伸时间过短即荧光读取时间不充分,荧光收集不能充分完成。

    适当增加延伸时间。

    以少于PCR仪器标准条件的反应体积进行扩增,荧光收集量的误差会增大

    应增加反应体积以满足PCR仪器标准。

     



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