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产品分类
 
·PCR
 
 





土壤基因组DNA提取试剂盒
 产品货号: RTG2403
 产品名称: 土壤基因组DNA提取试剂盒
 产品价格/规格: 50次 700元
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 更新时间: 2018-07-18
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    试剂盒内容及保存:

    试剂盒组成

    RTG2403

    50次)

    贮存方式

    缓冲液R1

    40 ml

    常温

    缓冲液R2

    6 ml

    常温

    缓冲液R3

    6 ml

    常温

    缓冲液R4

    10 ml

    常温

    缓冲液 R5(浓缩液)

    15 ml

    常温

    漂洗缓冲液WB1

    30 ml

    常温

    漂洗缓冲液PW (浓缩液)

    13 ml

    常温

    洗脱缓冲液EB

    15 ml

    常温

    Glass beads

    20 g

    常温

    吸附柱CG

    50

    常温

    收集管(2 ml

    50

    常温

    说明书

    1

     

     

    储存条件和效期:

    本试剂盒在室温(25℃左右)干燥条件下,可保存1年。缓冲液R2和R3可能有沉淀产生,若溶液产生沉淀,应在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。

    产品简介:

    土壤样品存在大量的抑制因子如腐殖酸、金属离子等,而纯化的DNA 中只要有这些微量物质的存在,都会影响到PCR等酶促反应。本公司的土壤试剂盒采用独特的腐殖酸去除液(缓冲液R2)能够有效去除腐殖酸;吸附柱CG能能有效去除金属等抑制因子,提纯得到的基因组DNA可直接用于PCR 反应,酶切或定量实验。

    准备工作:

    1. 准备55℃,70℃水浴;无水乙醇;异丙醇;制冰机;1.5ml离心管;2ml离心管

    2. 按照标签所示在漂洗缓冲液PW中加入无水乙醇;缓冲液R5中加入异丙醇,混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。

    3. 每次使用前请检查缓冲液R2,缓冲液R3是否有沉淀生成,如果出现沉淀,37℃温浴至沉淀溶解后再使用。

    标准操作步骤:

    如非指出,所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

    1. 0.3-0.5 g土壤置于2ml离心管中,加入0.4 g Glass Beads,再加入700 μl 缓冲液R1100 μl 缓冲液R2。涡旋器高速震荡3-5min

    注意:对含水量丰富的样品,可以预先离心除去部分水分后再称取样品。缓冲液R2是腐殖酸去除剂,100μl对大部分样品来说足以有效除去腐殖酸等抑制因子。对一些腐殖酸含量特别丰富的土壤, 缓冲液R2的量可以适当增加,但不能超过250μl,否则会严重影响DNA的得率。

    2. 加入100 μl 缓冲液R3R3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用),涡旋混匀。 70℃水浴处理10min。期间振荡几次。

       注意:如果要纯化革兰氏阳性菌的DNA,请在70℃处理完后,再90℃水浴处理2min

    3. 12000 rpm(~13,000g)离心1分钟,取600μl上清到1.5ml离心管中,加入180 μl 缓冲液R4混匀。

    注:转移上清时确保不要吸取到沉淀,转移的上清量最好不超过80%。

    4. 冰上放置5分钟。12000 rpm(~13,000g)离心1分钟。 转移上清到新的1.5ml离心管中。

    注:转移上清时确保不要吸取到沉淀,转移的上清量最好不超过80%。

    5. 加入与上清等体积的缓冲液R5(使用前请检查是否已加入异丙醇),颠倒混匀。

    6. 750 μl混合液加到吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12000 rpm(~13,000g)离心30秒,倒掉滤出液。

    7. 将剩余的混合液加到吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12000rpm(~13,000g)离心30秒,倒掉滤过液。

    8. 向吸附柱CG中加入500μl 漂洗缓冲液WB112,000 rpm (~13,000×g )  离心30 秒,倒掉废液。

    9. 向吸附柱CG中加入600μl 漂洗缓冲液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)12,000 rpm (~13,000g) 离心30 秒,倒掉废液,吸附柱CG放入收集管中。

    10. 向吸附柱CG中加入600μl漂洗缓冲液PW12,000 rpm (~13,000g) 离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CG放入收集管中。

    11. 12,000 rpm(~13,000g)离心2分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

    :此步骤非常重要,其目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。

    12. 将吸附柱CG转入一个干净的1.5ml离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50–100 μl70水浴预热的洗脱缓冲液EB,室温放置2分钟,12,000 rpm(~13,000g)离心2分钟。

    = 1 \* GB3 洗脱缓冲液体积最好不少于50 μl,体积过小影响回收效率。

    = 2 \* GB3 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内,pH值低于7.0会降低洗脱效率。

    13. DNA产物-20保存。

     

    大量操作步骤(针对含微量核酸的样品)

    1. 1-5g土壤置于10ml离心管中,加入1g Glass Beads,再加入3ml 缓冲液R1200μl 缓冲液R2。涡旋器高速震荡3-5分钟。

    2. 加入600μl 缓冲液R3,涡旋混匀。70水浴处理10分钟。期间振荡几次。

    3.3000g离心3分钟,转移上清到新的离心管中,加入550μl 缓冲液R4混匀。

    4. 冰上放置5分钟。8000g离心10分钟。转移上清到新的离心管中。

    5. 以下按标准操作步骤的第五步继续操作。

     

    DNA浓度及纯度检测:

    基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。提取的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。可配制0.8-1.0%琼脂糖凝胶,使用λ/HindIII判断基因组的大小,完整的基因组大小应在23kb以上。使用分光光度计检测时, OD260/OD280比值应为1.7–1.9之间,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水洗脱,比值可能偏低,但并不表明DNA纯度不高。


     

     

     

     

     

    常见问题分析:

     

    常见问题

    可能原因

    建议

    没有洗脱出DNA

    缓冲液R5没有加入异丙醇

    样品过柱前,必须用异丙醇调整核酸结合条件,否则核酸不能挂柱。

    漂洗缓冲液PW中没有加入乙醇

    漂洗缓冲液PW使用前请按照标签加入无水乙醇。无水乙醇加入量不正确会导致核酸提取量大大降低。

    低浓度的DNA

    缓冲液R2使用过量

    按照步骤1加入适量缓冲液R2

    洗脱体积太小

    洗脱体积不能低于50μl,如洗脱体积太小,回收率将大大降低。

    洗涤不恰当

    漂洗缓冲液PW使用前请按照标签加入无水乙醇。无水乙醇加入量不正确会导致核酸提取量大大降低。

    A260/A280比率

    蛋白污染

    不要忽略步骤8中用漂洗缓冲液WB1冲洗吸附柱

    洗脱液pH值不合适

    确保使用的洗脱液pH8.0以上,如低于8.0将导致DNA洗脱量过低。

    下游应用不好

    提取的DNA含盐量高

    漂洗缓冲液PW使用前请按照标签加入无水乙醇。

    提取的DNA含有乙醇

    步骤11空甩柱子2分钟非常关键,彻底去除漂洗液中的乙醇。

    抑制PCR反应

    增加缓冲液R2用量,彻底去除腐殖酸等PCR抑制因子;步骤4中确保不要吸取到沉淀。

     



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