Tris缓冲液介绍

Tris-HCl缓冲液

注：原文为“龙师兄实验室”公众号原创，略有修改。                                                

Ver 730464

在生化实验中，除了常用的PB和PBS缓冲液，还经常用到THB和TBS缓冲液，那什么是THB和TBS？ THB是Tris-HCl Buffer的缩写，中文翻译为“Tris-盐酸缓冲液”，依靠Tris(碱)和HCl(酸)对溶液起到缓冲维持溶液pH值的作用。实验室经常称呼为Tris缓冲液或者Tris-HCl缓冲液，下文统一称呼为Tris缓冲液。

TBS是Tris Buffered Saline 的简写，中文通常称为“三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液”，更准确地译名应该是“三羟甲基氨基甲烷缓冲生理盐水”，是生化实验广泛使用的一种缓冲溶液。通常是在THB的基础上加入0.9% NaCl（0.15 M），拥有和人体体液类似的渗透压。常用于清洗免疫染色的组织或Western Blotting中的蛋白印迹膜等。有时为了满足其它需求，需加入Tween-20，这就是常用的TBST（TBS with Tween-20）缓冲液。

Tris的历史：

Tris初次引起广泛注意的商业成功之一是在鱼的运输时降低了鱼的死亡率。在20世纪40年代，活鱼是在盛有海水的桶里运往市场的。不幸的是，许多鱼因CO₂的积聚使pH下降而致死。为了解决这个问题，在水中加入麻醉剂以便使鱼的代谢活动降至最低限度，即使这样也只能部分地得到缓解。1958年，McFarland和Norris在海水中加入Tris稳定其pH，的确降低了鱼的死亡率。Tris有很高的缓冲能力，在水中溶解度高，对很多酶反应是惰性的，Tris也成了用于许多生化目的非常满意的缓冲液，也是目前用于分子克隆中大多数酶反应的标准缓冲液。

缓冲pH范围:

Tris为弱碱，在常温（25℃）下，它的pKa为8.1，根据缓冲理论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH 7.1到9.1之间。0.1 M的水溶液pH为10.4，一般加入盐酸以调节pH值，即可获得所需pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于Tris的pKa的影响对于 Tris 缓冲液，温度每降低 1℃，pH 增加约0.03 个单位，浓度每稀释 10 倍，pH 降低 0.03-0.05 个单位。对于精确应用，使用带有玻璃/甘汞复合电极的经仔细校正的 pH 计。

Tris缓冲液的优点：

1.Tris为弱碱，可以只用一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液，应用范围广。

2. Tris缓冲液对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。

3. Tris在水中溶解度高，对很多酶的反应是惰性的。

4. Tris缓冲能力高，在pH7.5-9.0之间有较强的缓冲能力。

5. Tris缓冲剂应用广，在生物化学、分子生物学、体外诊断、化妆品、涂料等领域发挥重要作用。

Tris缓冲液的缺点：

1.在常温（25℃）下，Tris的pKa为8.1；根据缓冲理论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.1到9.1之间。实际操作中，在pH值小于7.5和大于9.0时，Tris的缓冲能力是非常低的。

2.Tris缓冲液的pH值受温度影响大，△pKa/℃＝-0.031 ，例如：4℃时缓冲液的pH=8.4，则37℃时的pH=7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0-4℃。

3.浓度对Tris解离有显著影响。例如，10 mM和100 mM Tris溶液的pH值会相差0.1pH单位，溶液的浓度越大则其pH值越高。

4.Tris作为伯胺，在一定程度上与各种分子反应，包括RNA酶抑制剂，醛，酶，DNA以及常见金属如Cr²⁺，Fe³⁺，Ni²⁺，Co²⁺和Cu²⁺等，在有些系统中会起抑制作用，在配制过程中需考虑与其他组分之间的相互作用。

5. Tris缓冲液易吸收空气中的CO₂，配制的缓冲液要注意盖严密封。

6. Tris与许多类型含有亚麻纤维接头的pH电极起反应，这种影响表现在电动势(emf)漂移，平衡时间加长。因此，具有亚麻纤维接头的电极不能精确测定Tris溶液的pH值。只能使用具有陶瓷或玻璃接头的电极测定Tris溶液的pH值。

7. Tris对许多哺乳动物有毒性。吸入、摄入、皮肤吸收Tris可造成伤害，操作时需戴好手套和护目镜；

8. 作为蛋白缓冲液时，若后续工作需要质谱，则不适宜用Tris，需换成其他质谱仪可耐受的缓冲液。

各种与Tris相关缓冲液的配制方法:

一、1×TBS的配制

1× TBS ( pH7.4 ) 的配制（0.02 M Tris，0.15 M NaCl，pH7.4）：2.4 g Tris ( 三羟甲基胺基甲烷 )，8.76 g NaCl ，950 ml超纯水， 磁力搅拌下滴加浓HCl至pH为7.4，再加超纯水定容至1000 ml，即可。如需含0.1% Tween-20，则在滴加HCl前先加入1ml Tween-20。

二、THB的配制

Tris-HCl缓冲液的两种配置方法：

第一种方法是用Tris-HCl粉末（MW 157.6）和Tris粉末（MW 121.14）按照不同比例混合，用水溶解即配成不同pH的Tris-HCl缓冲液。

另外一种方法是只用Tris粉末，用盐酸调节需要的pH值：以配置1 L 0.1 M的Tris-HCl缓冲液为例：先称12.11 g Tris碱溶于950 mL超纯水中，边搅拌边滴加浓盐酸，用pH计测定溶液所需的pH值，然后再加水补足到1 L即可。

配制50 mM Tris-HCl缓冲液 1升配制方法：

温度对 50 mM Tris-HCl液pH值的影响

三、TBST缓冲液

TBST是TBS + Tween的缩写，含有Tris-HCl，NaCl，Tween-20，是做Western Blot常用的一种洗膜缓冲液，1×TBST浓度为0.02 M Tris，0.15 M NaCl，0.1% Tween-20，pH7.4。WB实验中，为了防止曝光图背景太高，在孵育时，混有Tween 的TBST 能洗掉PVDF膜上非特异性吸附的蛋白质。Tween是一种离子表面活性剂，有复性抗原作用，可提高抗体特异性结合。TBST缓冲液于室温储存，若温度过低，会产生沉淀，可溶解或加热后使用。

四、TE缓冲液

TE缓冲液是Tris-HCl缓冲液 + EDTA，1×TE浓度为10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA pH8.0。为使用方便，TE缓冲液也可以配成10×或50×浓度。TE缓冲液是弱碱性，对DNA的碱基有保护作用，因此，DNA在TE中的稳定性较好，不易被破坏完整性或产生开环及断裂，TE缓冲液被用于DNA的稳定和储存。

五、TAE缓冲液

TAE缓冲液是将TE缓冲液中的盐酸换成乙酸（Tris/Acetate/EDTA），50×TAE浓度为2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA，~pH8.5。TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋电泳时更符合实际相对分子质量，且双链线状DNA在其中的迁移率较快，电泳大于13 kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也建议用TAE缓冲系统进行电泳。但是，TAE的缺点是缓冲容量弱，长时间电泳不建议使用。

六、TBE缓冲液

TBE缓冲液是将TE缓冲液中的盐酸换成硼酸（Tris/Borate/EDTA），5×TBE浓度为445 mM Tris-硼酸，10 mM EDTA，~pH8.3。TBE缓冲液常用于丙烯酰胺电泳以及琼脂糖凝胶电泳。TBE可用于长时间电泳，对较小片段分离效果较好。但是，超螺旋在TBE缓冲液中电泳时测出的相对分子质量会稍大于实际分子质量。另外，有文献报道，硼酸会影响DNA的连接，如果要进行凝胶回收的话，尽量不使用TBE缓冲液。