高分子量蛋白（大于150 kD）Western Blot攻略

高分子量蛋白（大于150 kD）Western Blot攻略

注：该文引自基因帮公众号天才试剂君文章，略有修改。  Ver.730875

● 一 选对凝胶很重要

三种最常见的凝胶系统包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate系统。

Tris-Glycine凝胶的pH为8.6，且保质期很短，一般4-8℃保存有效期一个月。在跑胶的过程中，凝胶系统的pH还有上升的趋势，可达到9.5，这会导致蛋白降解和低分辨率。

Bis-Tris凝胶的pH为~6.5，相对Tris-Glycine凝胶，稳定性和保质期都有所增加，4-8℃贮存可以保存一年。但这种凝胶更适合于低分子量电泳分离（低于200 kD），不适合高分子量蛋白电泳。

Tris-Acetate 凝胶的pH为~7，跑大分子蛋白会呈现很高的分辨率，同时4-8℃贮存可以保存一年。

所以跑大分子蛋白时，我们推荐使用Tris-Acetate 凝胶（货号：RTD6162；RTD6155）。

● 二 凝胶浓度很重要

既然选择了Tris-Acetate 凝胶，要考虑凝胶浓度的问题。凝胶浓度与孔径成反比：浓度越小，孔越大，较大的蛋白质更容易通过较大的孔，所以建议使用低百分比的Tris醋酸凝胶（货号：RTD6162），如6％等度胶。也可以使用梯度凝胶，但是制作梯度凝胶会恨棘手，需要一个梯度凝胶生成系统（货号：RT-GZY02），不过现在很多公司都会出售具有不同范围的梯度预制胶（货号：RTD6155），节省时间。

● 三 电泳内槽缓冲液需要添加抗氧化剂

Tris-醋酸电泳使用10×Tris-醋酸-SDS电泳缓冲液（货号：TA050），经典的Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液无法兼容使用。由于DTT在pH中性时，基本不随着样品泳动，为保证蛋白样品在电泳中维持还原力，Tris-Acetate 凝胶电泳时，电泳槽内槽缓冲液需要添加抗氧化剂（货号：TA1510），这样可以保证整个电泳过程中蛋白的变性还原状态，提高样品的分辨率。

● 四 提高转膜缓冲液中的SDS，减少甲醇

高分子量蛋白转膜缓冲液中的组成至关重要。如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀，可以通过减少转膜缓冲液中的甲醇百分比（10％或更低）来避免这种情况发生。为了进一步确保蛋白质不会沉淀，考虑在转膜缓冲液中添加SDS至终浓度为0.05%-0.1％。SDS向蛋白添加均匀的负电荷，使得它们更容易从凝胶转移到膜上。高分子量蛋白的转膜缓冲液可以选择10×Tris-醋酸转膜缓冲液（湿转，粉末型）（货号：TA5030P）

● 五 选择合适的转印膜

转印膜一般有PVDF膜或NC膜，跑大分子蛋白建议选择PVDF膜。如前面所说，如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜可以不需要在转膜缓冲液中添加甲醇，目的蛋白转印的机会更高。PVDF膜有各种孔径尺寸，最常见的是0.22 μm和0.45 μm。与凝胶一样，较大的蛋白比较小的蛋白更容易穿过大孔隙。高分子量蛋白质可以用0.45μm膜（货号：ML-PV-131545-5）转移，避免使用0.22 μm孔径。

● 六 增加转印时间

在正确的选择完凝胶、转印膜及转移缓冲液后，转印正式开始。半干转快且方便，但不适用于大分子蛋白。大分子蛋白建议湿转，因为大分子蛋白转移时间很慢，推荐350-400 mA转移90 min或 4℃，40 mA，转印过夜。

● 七 关于转印膜封闭

没有任何一种封闭试剂能通用于蛋白封闭。BSA通常作为NC膜的封闭液，但是对于PVDF膜，它的封闭效果并不是最好。大蛋白转膜后的封闭可以选择5%脱脂奶粉（货号：WN1070）。

另外，不要让PVDF膜在检测过程中的任何时间点干透，如果膜部分变干，可以让膜完全干掉，然后用甲醇重新润湿，之后用缓冲液浸泡，继续操作。