超滤离心管的使用
注：本文引自“分子庄园”公众号，略有修改。
超滤离心管是一种膜过滤设备，是用于分离液体中不同分子或粒子的装置。它利用特殊的超滤膜，通过应用压力将液体样品推动穿过膜，从而分离不同分子或粒子的大小，广泛用于蛋白质、DNA和生物分子的浓缩、纯化和脱盐。
一、超滤与微滤
1、微滤
微滤 (Microfiltration) 涉及利用微孔膜介质去除溶液中尺寸为 0.1 μm 至 10.0 μm 的颗粒或生物体。而超滤膜的过滤范围为0.01μm至0.1μm。
微滤膜广泛应用于生物制药行业中的预过滤和除菌过滤。 在细胞实验中，微滤最常用于样品和培养基的灭菌（0.1μm微滤膜可去除支原体）。
此外，在核酸和蛋白质分析之前，使用微滤膜可以有效地从细胞裂解物中去除完整的细胞和细胞碎片。 此步骤对于确保下游应用中结果的准确性至关重要。 通过微滤，研究人员可以获得纯化的样品，从而提高核酸和蛋白质相关研究的灵敏度和特异性。
2、超滤
超滤 (Ultrafiltration) 也是一种膜过滤，通过压力或浓度梯度等力使料液通过半透膜进行分离。 超滤膜能够截留尺寸范围为1-1000kDa（MW）的分子，并允许盐和水等小分子通过。
超滤是大分子脱盐、浓缩最方便的方法，已经在蛋白、抗体、病毒、核酸、囊泡等样品制备中建立标准操作。与沉淀法相比，超滤法更为温和，避免了可能导致生物大分子失活的相变。
水流的方向垂直于膜的表面，能最大限度的提高水通量，在压力差的作用下，水和小于膜孔的颗粒或物质透过膜，大于膜孔的颗粒则被膜截留。死端过滤随着过滤时间的延长，被截留颗粒将在膜表面形成污染层，阻塞膜孔，使过滤阻力增加，在操作压力不变的情况下，膜的过滤透过率将下降；而增加压力则可能是膜破裂。因此，死端过滤只能间歇进行，必须周期性地清除膜表面的污染物层或更换膜。又叫错流过滤（cross flow filtration）：水流的方向平行于膜的表面，可以大量减少污染物在表面的富集，因为水流会将其带走，同时也减少了堵孔的概率，使膜的通量能够保持，同时，膜上面承受的压力也更小，可以延长膜的使用寿命。错流过滤运行时，水流在膜表面产生两个分力，一个是垂直于膜面的法向力，使水分子透过膜面，另一种是平行于膜面的切向力，把膜面的截留物冲刷掉。因此，错流过滤的滤膜表面不易产生浓差极化现象和结垢问题，过滤透过率衰减较慢。错流过滤的运行方式比较灵活，既可以间歇运行，又可以实现连续运行。
三、超滤离心管
超滤离心管是一种利用离心力驱动中小体积溶液通过超滤膜，进行快速浓缩、渗滤和缓冲液置换的装置。 它由盖子、过滤装置和离心管组成。
中间的过滤装置既可用于渗透样品，也可以用于保留样品。当目标分子明显小于滤膜孔径时，可使用超滤离心管对大分子污染物进行除热源、澄清和分离。目标样品会透过滤膜并保留在离心管内。如果目标分子远大于膜孔径，则小分子污染物将被滤除，目标分子将集中在过滤装置中。垂直设计的超滤膜具有更大的有效滤膜表面积，有助于快速的样本处理，获得较高的样本回收率（通常>90%），并达到数十倍的浓缩，同时也最大程度降低了大颗粒或大分子量物质堵塞滤膜。死体积设计能有效防止过度离心使样本干掉而造成样本损失。
收集滤出液后，浓缩样本（截留部分）可通过一个简便的倒置（上下反转）离心步骤而实现高效回收。反转离心回收设计使蛋白样品，特别是小体积样品得到高效回收，避免枪头吸取造成的样品丢失或操作错误。
超滤管采用切向流过滤技术，是一种以筛分为分离原理，以压力为推动力的膜分离过程。用于截留水中颗粒和大分子物质，而水和小分子物质则允许透过膜，过滤精度在0.001-0.01μm（分子量1kD-1000kD）范围内，可有效除去有机溶剂或者小分子物质，相反，也可以截留水中的微粒、胶体、细菌、热源及高分子聚合物。选择超滤离心管需要考虑样品起始量以及超滤膜的截留分子量(MWCO)。影响截留和产物回收率的因素有很多，如分子构象、带电特性、样品浓度、操作条件等。而且超滤管上的截留分子量只是平均孔径，实际孔径是在左右正太分布的。
一般建议选择截留分子量要比要浓缩的目标大分子的分子量小2-3倍的超滤膜，然后根据要处理的样品体积选择不同尺寸的超滤离心管。
为防超滤膜干裂和长菌，通常超滤离心管内会附带少量甘油和叠氮化钠用于保护和储存，在使用前需润洗去除。一般是向超滤装置中加入纯水、去离子水或缓冲溶液，离心使溶液完全过膜，然后离心管中的所有液体。如果干扰仍然存在，可用0.1 M NaOH清洗，再用20％的乙醇清洗，最后用缓冲液或超纯水水清洗并甩干。超滤膜一旦润湿后就需保持湿润避免变干直至使用结束，如果预清洗后没有立即使用，可用20％的乙醇浸泡保存，务必保持滤膜润湿，防止长菌。
5、超滤管的放置
超滤管在离心机中的摆放需要符合切向流过滤要求，即水流方向与膜面平行。
1）水平转子
使用水平转子时放置没有特殊要求。
水平转子又称甩平转子、荡平转子，转头静止时，处于转头中的离心管中心线与旋转轴平行，转头旋转加速时，离心管中心线由平行位置逐渐过渡到垂直位置，即与旋转轴成90?角。此种转子主要用于样品做密度梯度离心，颗粒移动距离长，相应离心时间一般也较长，溶液中的组分相对于管壁的位置在离心过程中和离心后不发生改变，因此离心效果好，能够分离密度差小的样品。
2）固定角转子
使用角转子时，双面垂直膜超滤管放置方式要求滤膜侧向相对。
单面垂直膜要求滤膜膜面朝下，这样滤膜才能发挥切向流的作用。
有尖角的超滤管应使尖角朝上以便样品进入尖角，让样品收集更加方便，此外，死体积设计能有效防止过度离心使样本干掉而造成样本损失。固定角转子中离心管与转子的转轴之间有一定的角度，角度变化范围通常在14?-45?。此种转子重心低，寿命长，容量较大，转速较高，能承受的最大离心力可达800000g，主要用于分离沉降速度有明显差异的颗粒样品。颗粒在扇形溶液移动的距离很短，碰到外壁的颗粒沿着管壁滑到管底，形成沉淀，因此这种转子能很快地收集沉淀物。
6、超滤管的截留分子量和膜孔径关系
超滤管是一种膜过滤设备，用于分离液体中不同分子或粒子的装置。它利用特殊的超滤膜，通过应用压力将液体样品推动穿过膜，从而分离不同分子或粒子的大小。这种分离过程基于分子截留量，也就是膜的孔径大小，决定了哪些分子可以通过膜，哪些分子被截留在膜上。
分子截留量是表示超滤膜的选择性的重要参数，通常以道尔顿（Da）为单位，分子截留率表示膜可以截留的最大分子或粒子的大小。具体来说，如果膜的分子截留率是10kD，则该膜能够截留分子量小于或等于10000的分子，而分子量大于10000的分子将被截留在膜上。
道尔顿是用来表示分子质量或原子质量的单位，一个分子的道尔顿数值大约等于其相对原子质量或相对分子质量。
截留分子量和孔径之间的关系是复杂的。通常超滤膜的截留分子量是指在一定条件下,某些分子量的物质被膜截留，被截住物质的最小分子量即为膜的截留分子量，用以表征膜的分离能力；而孔径则是反映膜的通透性的重要参数。分子量通常用单位为Dalton(Da)表示，而孔径大小通常用单位为纳米(nm)表示。
超滤膜截留的分子量10000、30000、50000 60000、100000、200000、300000、500000、1000000，对应超滤膜孔径(μm) 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.1。也就是说100kd（10万）的截留分子量对应50nm的孔径。
从数据上看,似乎存在一种对应关系，如超滤膜截留分子量为100kD（10万）时,对应的孔径为0.05μm。但这种关系并不完全准确。因为超滤膜的孔径和分子量的关联并非简单的线性关系，对于具体的过滤器或分离膜，其材料、制备方法、孔径大小分布等因素都会影响它们之间的关系。
7、超滤管的离心
超滤管如果离心转速过高，可能会导致膜甚至管子的破裂，做实验时要根据不同品牌超滤管的说明书中明确指出的最大转速和离心力，调整离心转速到超滤管的承受范围内。
离心机的转速与离心机的半径以及离心力都有关系，不同半径的离心机，相同转速出来的离心力也不一样。离心力g和rpm（转／min）转换公式：g=r×11.8×10??×rpm2，其中g有时用相对离心力（RCF）表示。
r 为有效离心半径，即从离心机轴心到离心管底的长度，单位为厘米（cm）。
8、超滤管使用建议
1）超滤管不能进行高压灭菌，可使用70%乙醇或环氧乙烷灭菌。
2）超滤管一般不建议重复使用超过5次。受到样品性质的影响，先用0.1M的NaOH浸泡1-2h，然后用20%乙醇清洗，最后用超纯水或缓冲液清洗3次，即可再用。
3、如果样品是线性蛋白，需使用较低的离心速度和时间避免蛋白降解。
4、浓缩过快或者过度浓缩可能会引起蛋白沉淀。建议蛋白浓缩后最终浓度不超过20mg/ml，同时降低离心速度并改用截留分子量更大的超滤管。
建议的改进方法是：①离心力降为推荐离心力的30%-50%；②改用截留分子量大的超滤管(如原本选用10kD，此时可以选择30kD)；③取出超滤管, 用吸头反复吹吸几次后再继续浓缩。
6、过滤速率受到超滤管MWCO，样品浓度，粘度，离心力和温度的影响。如果样品中固体含量超过5%，离心时间需要增加。当在4℃下运行时，流速大约比25℃时慢1.5倍。粘性溶液(如50%甘油)的浓缩时间大概是常规溶液的5倍。
7、如果要用超滤的方法分离两种蛋白，按照经验，两个蛋白的分子量要相差一个数量级（10 倍）。
8、担心浓缩过程中目的蛋白和超滤膜之间可能存在非特异性吸附，可尝试以下操作：①确保蛋白浓度不要过低；②尽量选用纤维素的低吸附超滤；③选用小体积超滤管，通过减小膜面积来降低非特异性吸附；④使用前可以先对膜进行封闭：1%脱脂奶粉，1%BSA，5%Tween 20，5%SDS，5%TritonX-100，5%PEG3000（不影响蛋白活性，不影响蛋白后续使用的前提下）。
9、对于有些样品含量非常少的情况，可尝试一下操作：①尽量选择较小的截留分子量的超滤管；②选择带有尖角收集器的超滤管以便最大限度回收样品；③使用水平转子优于角转子；④浓缩完用缓冲液清洗多次回收, 注意移液器的枪头不要碰到膜，以免膜破裂；⑤使用前可以先对膜进行封闭。