琼脂糖凝胶电泳后的 DNA 条带异常现象
你是否在 DNA 电泳后遇到过这种现象呢？
DNA Marker 或样品的某些条带呈笑脸型、W 型、亮度异常，多条条带堆叠在一起、无法区分开，或者出现拖尾现象
这些都会影响 Marker 的功能，使样品的条带大小和浓度难以准确预估
技术背景
核酸电泳是进行核酸研究的重要手段，是核酸探针、核酸扩增和序列分析等技术所不可或缺的组成部分。
溴化乙锭（EB）由于价格便宜，常用于琼脂糖和 PAGE 凝胶中的核酸染色。但 EB 是强致癌诱变剂，由于其分子量较小，极易渗透细胞膜与胞内 DNA 分子嵌合，进而影响 DNA 的复制，破坏正常的遗传生理现象。
鉴于此，很多厂家研发了大分子的新型核酸染料，新型核酸染料由于分子较大，更难进入细胞，所以安全性更高。而且灵敏度更高，比如 GelRed 大约是 EB 的 4～5 倍。
EB 与 GelRed 灵敏度对比
但也正是新型染料分子较大，会影响 DNA 分子在电泳时的迁移，所以 DNA 条带在电泳中可能发生扭曲、变形、拖尾现象。
核酸染料结合 DNA 后改变了 DNA 的空间结构，使原本带负电荷的电量减少，DNA 分子增大。
这一系列改变使得 DNA 分子在琼脂糖凝胶电泳中的相互作用力改变，运动特点和未结合核酸染料的 DNA 分子也有所不同，这些因素共同导致 DNA 分子的形态在运动中发生了改变。特别是对大分子量的 Marker，可能导致 Marker 条带变形、分不开的现象。
根据核酸染色和电泳的先后顺序，核酸电泳一般可分为预染法（前染法）和泡染法（后染法）两种方法, 在凝胶中添加染料称为预染法，电泳完成之后再进行染色称为泡染法。
我们实验中经常用到的就是预染法，但预染法在电泳中可能遇到上述的一些问题，而由于泡染法是电泳后再染色，可有效避免上述现象的产生。
实验案例
下面，以我们东盛生物的新型核酸染料 DSRed（货号：M7021）和 22 种 DNA Marker 为实验材料，做一个预染法与泡染法中核酸染料对ＤＮＡ条带形态影响的验证：
我们选择了不同大小的 Marker 并对其分类，分别用 1%、1.7%、3% 浓度的凝胶进行了预染法和泡染法电泳对比。
以下左图为预染结果，右图为泡染结果：
Figure.1 适合 1% 凝胶浓度的 DNA Marker（大片段较多）的预染/泡染对比（1）
Figure.2 适合 1% 凝胶浓度的 DNA Marker（大片段较多）的预染/泡染对比（2）
Figure.3 适合 1.7% 凝胶浓度的 DNA Marker（片段大小适中）的预染/泡染对比
Figure.4 适合 3% 凝胶浓度的 DNA Marker（小片段较多）的预染/泡染对比
结果分析：
从 fig.1 到 fig.4 的整体对比中可以清晰的看出，Marker 在预染胶中的条带会发生弯曲成「W」型，且条带大小越大，弯曲越明显；而在泡染胶中，电泳时没有染料的影响，条带基本正常。
从 fig.1、fig.2 的两种方法的对比中可以看出，在预染胶中，5kb 及以上的大分子 DNA 条带更容易会出现变形、分不开的现象，而在泡染胶中 Marker 条带是清晰分开的。
此外，DNA 的浓度也是需要考虑的因素，浓度越高，则结合的染料分子越多，迁移阻力也越大，同样更容易出现条带变形或分不开的问题。
总结
由于新型核酸染料会影响 DNA 分子在电泳时的迁移，特别是大分子的核酸，所以，如果在实验中用到大分子量的 DNA Marker 或者用预染法电泳时 Marker 条带出现弯曲、分不开的现象，建议使用泡染法进行染色。
此外，使用新型染料预染时一定要注意 Marker 及样品用量。由于不同 Marker 的浓度不一样，因此可以做几个梯度进行加样，选择较合适的用量。也可以用 1X 上样缓冲液对 Marker 进行不同倍数稀释后使用，可以更有效地改善条带异常的问题。不过只有使用后染法才能真正避免染料对核酸迁移的影响。
延伸问题：
Q1: 为什么同时电泳的样品 DNA 条带正常？
A: 因为样品往往是单一条带，或条带数量比较少，没有 Marker 那么多，那么就不容易产生条带间的挤压，所以看起来是比较正常的。但是大片段或高浓度片段会结合较多的染料，因此迁移速率依然会降低，所以也要注意样品用量。必要时建议采用后染法进行染色。
Q2: 为什么上面的预染实验结果没有出现条带剧烈变形、堆积、亮度很高的情况？
A: 因为严格按照使用建议添加了适量的染料，使其终浓度为 1X，而不是随意添加一些使其过量，那样非常容易加重 DNA 条带异常的情况。
后染法真的很麻烦吗？
后染并不麻烦，而且配制的染色液可以多次使用，缺点是比前染法稍微耗费染料、染色时间长（20~30 min）、灵敏度略低一些。
但是 5kb 及以上片段较多、浓度较高的 Marker 或样品，如果前染的结果已经如本文开头那样差了，那么建议还是用后染法得到一张清晰好看的电泳图。
后染法与前染法效果对比
含有 5kb 及以上的 DNA 片段建议采用后染法
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