Western Blot产品选择指南
Western Blot产品选择指南 Ver.730756
Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。
1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)
可以使用适当的裂解液，例如Real-Times生产的Western及IP细胞裂解液(货号：WL1020)、RIPA裂解液（强）（货号：RL1020）等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用Real-Times生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：RTP7102)，此试剂盒对裂解液中的去垢剂浓度有较好的兼容性。如果裂解液中还原剂（巯基乙醇或DTT）浓度较高，请选择Bradford蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7101）；当蛋白样品中同时含有一定浓度的去垢剂和还原剂时，请选择Bradford蛋白浓度测定试剂盒（去垢剂兼容型）（货号：RTP7104）。
2. 电泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用Real-Times生产的SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（货号：RTD6123），该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂，可以配制各种浓度SDS-PAGE的配方，经济便捷。另外，也可以选择SDS-PAGE凝胶快速制备及电泳试剂盒(货号：RTD6116)，此试剂盒提供了从凝胶制备到凝胶电泳的所有试剂。另外，公司研发RealPAGE plus彩色凝胶快速制备试剂盒（货号：RTD6132），彩色上层胶，方便上样；上层胶和下层胶溶液1:1混合，无需计算，极大简化配胶步骤。另外，公司还研发了多种浓度的预制胶，省去了制胶步骤，即开即用。
(2) 非变性PAGE凝胶配制
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）是在凝胶中不加入SDS和巯基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行凝胶电泳。蛋白质在电泳过程中是处于非变性的，电泳时蛋白的迁移率取决于蛋白的电荷和分子量。非变性蛋白电泳分为经典非变性电泳，BN非变性电泳，碱性蛋白非变性电泳。经典非变性电泳也称为Laemmlie非变性电泳，分离胶体系的pH为8.8，大多数蛋白质在这个条件下是带负电的。因此经典非变性电泳也称为酸性非变性电泳，适合于分离等电点低于8.0的蛋白。产品可以选择非变性PAGE凝胶制备及电泳试剂盒（货号:RTD6130），此试剂盒需要手灌胶，提供了从凝胶制备到凝胶电泳的所有试剂。也可以选择非变性凝胶蛋白电泳试剂盒（含预制胶）（货号：RTD6135）。碱性蛋白非变性电泳用于等电点高于8.0的蛋白，产品可以选择碱性蛋白非变性PAGE凝胶制备及电泳试剂盒（货号:RTD6131）。BN（Blue Native）非变性电泳是一种从生物样品中分离蛋白质复合物的电泳技术，主要用于膜蛋白的非变性分离，产品可以选择Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒（货号：RTD6139）。
(3) 样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2×或5×的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5×的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5×的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用Real-Times生产的5×MonoClolor 蛋白上样缓冲液(货号：PL080)或者5×DualClolor 蛋白上样缓冲液（货号：PL090）。后者含有一种红色染料，可以转移到膜上，方便检测蛋白的转移效果。 样品与上样缓冲液混合后，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
(4) 上样与电泳
样品凉至常温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用蛋白质Marker。
电泳时电泳液可以使用Real-Times生产的 5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液（变性电泳）(货号：TG120)。
电泳时通常推荐在上层胶（浓缩胶）时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶（分离胶）时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120-150V左右。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)
我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(货号：ML-PV-131545-5 孔径0.45μm或货号：ML-PV-131522-5 孔径0.22μm)。硝酸纤维素膜(NC膜)( 货号：ML-NC-152045-5)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子（货号：BPNZ）夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置或Real-Times生产的转印槽（货号：RT-ZY01），转膜时可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定。Real-Times提供方便装的1×Western湿转转膜液（货号：TB1030P）。目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜也可以选择半干转转膜法，Real-Times提供方便装的1×Western半干转转膜液（货号：SD1030）。半干转有快速转膜，节省缓冲液等优点，但需要转膜的半干转仪器。
另外，Real-Times研发了10×RealBlot快速转膜液（货号：RT5020），能在15-35分钟内完成转膜过程高效快速地将蛋白转移到印迹膜（PVDF或硝纤膜）上，不含甲醇，绿色环保，完美替代经典的湿转和半干转转膜方法。
转膜时要注意隔层之间不能有气泡，可以使用Western专用滚轴（货号：Roller）去除气泡。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液(货号：RTD6301)对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用FastBlue蛋白快速染色液（货号：RTD6202）对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4. 封闭(Blocking)
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的1×TBS（货号：TB5040）中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
吸尽洗涤液，加入Western封闭液(货号：WB1070/WN1070/WP1015)，在摇床上缓慢摇动,常温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。对于磷酸化抗体检测，可以选用Western无蛋白快速封闭液（货号：PF1070），本品专为快速高效封闭Western Blot 转印膜而设计，采用无蛋白配方，避免抗体与封闭剂的非特异结合，最大程度地降低了背景。
5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液(货号：WP1080)稀释一抗。
吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，常温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。
回收一抗。加入Western洗涤液或1×TBST（货号：TB5070P），在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
注：Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用GAPDH抗体（货号：RGA1040），Tubulin抗体或Actin抗体，进行内参检测。
6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液(货号：WS1056)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是兔来源的IgG，则二抗需选择抗兔IgG的二抗，如HRP标记山羊抗兔IgG（货号：HGR1020）。
吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，常温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
回收二抗。加入Western洗涤液或1×TBST（可由10×TBST稀释），在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7. 蛋白检测(Detection of proteins)
参考相关说明书，使用RealECL发光液(货号：EC2520)来检测蛋白。压片可以采用专用的压片暗盒（货号：ANHE507）进行。
洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以自行配制显影液（货号：XYF）和定影液（货号：DYF）进行手工洗片。
8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液（货号：WS1080/WS1090/WS1100/WS1200）处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。