植物Rubisco测定试剂盒
● 产品组成：Plant Rubisco
Assay Kit
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组分货号
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名称
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规格
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贮存
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运输
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PU1060-01
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试剂1-Rubisco提取缓冲液（2×）
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100 ml
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4℃
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常温
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PU1060-02
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试剂2-10×Assay buffer
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15 ml
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-20℃
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常温
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PU1060-03
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试剂3-GAPDH（200×）
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1 KU/1ml
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-20℃
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常温
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PU1060-04
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试剂4-PGK（100×）
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500 U/1ml
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4℃
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常温
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PU1060-05
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试剂5-CPK（100×）
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1 KU/1ml
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-20℃
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常温
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PU1060-06
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试剂6-ATP（100×）
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1.2 ml
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-20℃
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常温
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PU1060-07
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试剂7-CrP（100×）
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1.2 ml
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-20℃
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常温
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PU1060-08
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试剂8-NADH（100×）
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1.2 ml
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-20℃
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常温
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PU1060-09
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试剂9-RuBP
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1.4 ml×2
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-20℃
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常温
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PU1060-10
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试剂10-酶溶解缓冲液
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5 ml
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-20℃
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常温
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DE005
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试剂11-灭菌水
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100 ml
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4℃
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常温
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BSA-02
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试剂12-BSA溶液 50mg/ml
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5 ml
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-20℃
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常温
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DT0140P
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试剂13-1MDTT（100×）
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1 ml×2
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-20℃
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常温
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PC2030-01
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蛋白酶抑制剂 植物样品提取用(100×)
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1 ml
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-20
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常温
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● 产品简介：
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用碳代谢中的重要的调节酶，是植物中最丰富的蛋白质，主要存在于叶绿体的可溶部分，总量约占叶绿体可溶蛋白50％～60％。
这里1分子CO2被固定，就有2分子 NADH 被氧化。因此，由NADH氧化的量就可计算Rubisco的活性，由340nm吸光度的变化可计算NADH氧化的量。
为了使NADH的氧化与CO2的固定同步，需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系统。
按照1 ml 反应体系计算，该试剂盒可以测定80-100个样品。
● 自备材料：
植物材料；剪刀；液氮；研钵或其他研磨设备；1.5ml离心管；1ml石英比色皿；紫外分光光度计；制冰机；低温离心机
● 操作步骤：
一、 即用型Rubisco提取缓冲液配制：
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一个反应配制体积
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n个反应配制体积
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1 ml
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n×1 ml
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Rubisco提取缓冲液（2×）
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0.5 ml
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n×0.5 ml
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灭菌水
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470 μl
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n×470 μl
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1 M DTT（100×）
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10 μl
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n×10 μl
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BSA溶液50mg/ml
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20 μl
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n×20μl
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蛋白酶抑制剂（100×）
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10 μl
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n×10μl
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注：1. 即用型Rubisco提取缓冲液尽量现配现用，短期4℃中可以过夜保存。
2. 为增强Rubisco的稳定性，提取缓冲液中可以加入蛋白酶抑制剂（Cat：PC2030）
二、 Rubisco样品提取：
1. 取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，液氮中研磨，1 cm2叶片（1分硬币大小）或0.1g粉末加入1 ml 即用型Rubisco提取缓冲液，颠倒混匀，冰浴放置5-10分钟。
2.12000g4℃离心 10分钟，上清即为Rubisco样品提取液，常温放置备用（不要冰浴或4℃放置，常温放置可以保持Rubisco活性）。
注：Rubisco样品提取液最好立即测定，不建议保存。
三、 Rubisco活性测定分析：
1. 即用型酶溶解缓冲液配制：
按照标签所示，在试剂10-酶溶解缓冲液原瓶中加入1.5 ml灭菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混匀后即配成即用型酶溶解缓冲液，冰浴备用，-20℃保存。
2. 试剂3-GAPDH和试剂5-CPK按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液，混匀溶解后冰浴备用，-20℃保存。
3. 试剂4-PGK为硫酸铵悬浮液，4℃12000g离心5分钟，去除上清（小心去除，可以保留少许上清，不要吸弃沉淀），沉淀中按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液，混匀溶解后冰浴备用，-20℃保存。
4. 试剂9-RuBP：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
注：RuBP溶液稳定性较差，用后-20℃保存，有效期3-4天，长期-80℃保存。
5. 试剂8-NADH：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
注：NADH稳定性较差，用后-20℃贮存3-4天，长期-80℃保存。
6. 反应体系MasterMix配制：
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加入顺序
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组份
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1ml反应体系加入量
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MasterMix配制
（测定n个样品为例）
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1
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10×Assay
Buffer
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100 μl
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n×100μl
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2
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灭菌水
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795μl
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n×795μl
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3
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ATP溶液（100×）
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10 μl
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n×10μl
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4
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CrP溶液（100×）
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10 μl
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n×10 μl
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5
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GAPDH溶液（200×）
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5 μl
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n×5 μl
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6
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PGK溶液（100×）
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10 μl
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n×10 μl
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7
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CPK溶液（100×）
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10 μl
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n×10 μl
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8
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NADH溶液（100×）
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10 μl
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n×10 μl
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7. 反应体系测定；
1.5 ml离心管中配制以下反应。
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1
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2
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3
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对照反应
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初始活性测定
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总活性测定
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MasterMix
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950 μl
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950 μl
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950 μl
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即用型Rubisco提取缓冲液
（步骤一）
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25 μl
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-
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-
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Rubisco样品提取液
（步骤二）
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-
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25μl
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25μl
常温放置15分钟
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试剂9-RuBP溶液
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25
μl
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25 μl
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25μl
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加入RuBP后立即测定OD340读数，记录60秒内OD340值变化。
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注：一般分光光度计OD340读数在0.5-3之间数据比较准确，低于此范围说明提取用的材料太少，Rubisco活性太低；高于此范围说明所用材料太多，Rubisco活性太高，此时可以将Rubisco样品提取液用即用型Rubisco提取缓冲液稀释后测定。
四、Rubisco活性计算：
根据如下公式计算样品中Rubisco活初始性和总活性：
Activity（μmol·m-2·S-1）-表示每秒每平方米叶片有多少μmol NADH被氧化
△A-反应最初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值
N-稀释倍数，本程序中为40（1 ml提取液，取25μl测定）。
6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数
d-cm 比色皿光程，一般为1
△t-秒 测定时间，本程序为60秒
S-cm2 提取时使用的叶面积
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