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植物Rubisco活性测定试剂盒
 产品货号: PU1060
 产品名称: 植物Rubisco活性测定试剂盒
 产品价格/规格: 80-100次 6000元
 产品说明书: 暂无
 更新时间: 2019-08-08
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    植物Rubisco测定试剂盒

    产品组成:Plant Rubisco Assay Kit

    组分货号

    名称

    规格

    贮存

    运输

    PU1060-01

    试剂1-Rubisco提取缓冲液(2×)

    100 ml

    4

    常温

    PU1060-02

    试剂2-10×Assay buffer

    15 ml

    -20℃

    常温

    PU1060-03

    试剂3-GAPDH200×)

    1 KU/1ml

    -20℃

    常温

    PU1060-04

    试剂4-PGK100×)

    500 U/1ml

    4℃

    常温

    PU1060-05

    试剂5-CPK100×)

    1 KU/1ml

    -20℃

    常温

    PU1060-06

    试剂6-ATP100×)

    1.2 ml

    -20

    常温

    PU1060-07

    试剂7-CrP100×)

    1.2 ml

    -20

    常温

    PU1060-08

    试剂8-NADH100×)

    1.2 ml

    -20

    常温

    PU1060-09

    试剂9-RuBP

    1.4 ml×2

    -20℃

    常温

    PU1060-10

    试剂10-酶溶解缓冲液

    5 ml

    -20℃

    常温

    DE005

    试剂11-灭菌水

    100 ml

    4℃

    常温

    BSA-02

    试剂12-BSA溶液 50mg/ml

    5 ml

    -20

    常温

    DT0140P

    试剂13-1MDTT100×)

    1 ml×2

    -20

    常温

    PC2030-01

    蛋白酶抑制剂 植物样品提取用(100×)

    1 ml

    -20

    常温

    ●     产品简介:

    核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用碳代谢中的重要的调节酶,是植物中最丰富的蛋白质,主要存在于叶绿体的可溶部分,总量约占叶绿体可溶蛋白50%~60%。

    这里1分子CO2被固定,就有2分子 NADH 被氧化。因此,由NADH氧化的量就可计算Rubisco的活性,由340nm吸光度的变化可计算NADH氧化的量。

    为了使NADH的氧化与CO2的固定同步,需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系统。

     按照1 ml 反应体系计算,该试剂盒可以测定80-100个样品。

    自备材料:

    植物材料;剪刀;液氮;研钵或其他研磨设备;1.5ml离心管;1ml石英比色皿;紫外分光光度计;制冰机;低温离心机

    操作步骤:

    一、 即用型Rubisco提取缓冲液配制:

     

    一个反应配制体积

    n个反应配制体积

     

    1 ml

    n×1 ml

    Rubisco提取缓冲液(

    0.5 ml

    n×0.5 ml

    灭菌水

    470 μl

    n×470 μl

    1 M DTT100×

    10 μl

    n×10 μl

    BSA溶液50mg/ml

    20 μl

    n×20μl

    蛋白酶抑制剂(100×

    10 μl

    n×10μl

    注:1. 即用型Rubisco提取缓冲液尽量现配现用,短期4中可以过夜保存。

    2. 为增强Rubisco的稳定性,提取缓冲液中可以加入蛋白酶抑制剂(CatPC2030

     Rubisco样品提取:

    1. 取新鲜植物组织,清洗干净,擦干,液氮中研磨,1 cm2叶片(1分硬币大小)或0.1g粉末加入1 ml 即用型Rubisco提取缓冲液,颠倒混匀,冰浴放置5-10分钟。

    2.12000g4离心 10分钟,上清即为Rubisco样品提取液,常温放置备用(不要冰浴或4℃放置,常温放置可以保持Rubisco活性)。

    注:Rubisco样品提取液最好立即测定,不建议保存。

     Rubisco活性测定分析

       1. 即用型酶溶解缓冲液配制:

          按照标签所示,在试剂10-酶溶解缓冲液原瓶中加入1.5 ml灭菌水和1 ml BSA溶液(50mg/ml),混匀后即配成即用型酶溶解缓冲液,冰浴备用,-20℃保存。

    2. 试剂3-GAPDH和试剂5-CPK按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液,混匀溶解后冰浴备用,-20℃保存。

       3. 试剂4-PGK为硫酸铵悬浮液,4℃12000g离心5分钟,去除上清(小心去除,可以保留少许上清,不要吸弃沉淀),沉淀中按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液,混匀溶解后冰浴备用,-20℃保存。

    4. 试剂9-RuBP:按照标签所示加入灭菌水,彻底混匀后冰浴备用。

    注:RuBP溶液稳定性较差,用后-20℃保存,有效期3-4天,长期-80℃保存。

    5. 试剂8-NADH:按照标签所示加入灭菌水,彻底混匀后冰浴备用。

    注:NADH稳定性较差,用后-20℃贮存3-4天,长期-80℃保存。

    6. 反应体系MasterMix配制:

    加入顺序

    组份

    1ml反应体系加入量

    MasterMix配制

    (测定n个样品为例)

    1

    10×Assay Buffer

    100 μl

    n×100μl

    2

    灭菌水

    795μl

    n×795μl

    3

    ATP溶液(100×

    10 μl

    n×10μl

    4

    CrP溶液(100×

    10 μl

    n×10 μl

    5

    GAPDH溶液(200×

    5 μl

    n×5 μl

    6

    PGK溶液(100×

    10 μl

    n×10 μl

    7

    CPK溶液(100×

    10 μl

    n×10 μl

    8

    NADH溶液(100×

    10 μl

    n×10 μl

    7. 反应体系测定;

    1.5 ml离心管中配制以下反应。

     

    1

    2

    3

     

    对照反应

    初始活性测定

    总活性测定

    MasterMix

    950 μl

    950 μl

    950 μl

    即用型Rubisco提取缓冲液

    (步骤一)

    25 μl

    -

    -

    Rubisco样品提取液

    (步骤二)

    -

    25μl

    25μl

    常温放置15分钟

    试剂9-RuBP溶液

    25 μl

    25 μl

    25μl

     

     

    加入RuBP后立即测定OD340读数,记录60秒内OD340值变化。

    注:一般分光光度计OD340读数在0.5-3之间数据比较准确,低于此范围说明提取用的材料太少,Rubisco活性太低;高于此范围说明所用材料太多,Rubisco活性太高,此时可以将Rubisco样品提取液用即用型Rubisco提取缓冲液稀释后测定。

    Rubisco活性计算:

    根据如下公式计算样品中Rubisco活初始性和总活性:

    Activity(μmol·m-2·S-1)-表示每秒每平方米叶片有多少μmol NADH被氧化

    △A-反应最初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值

    N-稀释倍数,本程序中为40(1 ml提取液,取25μl测定)。

    6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数

    d-cm 比色皿光程,一般为1

    t-秒 测定时间,本程序为60秒

    S-cm2 提取时使用的叶面积



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