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RTU4082 植物原生质体制备试剂盒
 产品货号: RTU4082
 产品名称: RTU4082 植物原生质体制备试剂盒
 产品价格/规格: 40次 1200元
 产品说明书: 暂无
 更新时间: 2021-01-21
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  • 植物原生质体制备试剂盒                                       


    货号

    名称

    包装

    RTU4082

    植物原生质体制备试剂盒

    5 ml×40

     

    ●  产品组成:

    序号

    组分货号

    名称

    规格

    贮存

    运输

    1

    RTU4052-01

    溶液I-2×酶溶解溶液

    100 ml

    -20℃

    RT

    2

    RTU4082-02

    溶液II-5×W5 Solution

    50 ml

    -20℃

    RT

    3

    RTU4052-03

    溶液III-MMG Solution

    25 ml

    -20℃

    RT

    4

    BME

    还原剂

    1 ml

    RT

    RT

    5

    BSA-02

    50mg/ml BSA溶液

    5 ml

    -20℃

    RT

    6

    CYL0014

    Enzyme Premix酶混合物

    4 g

    -20℃

    RT

    7

    RT-1070

    70 μm细胞过滤器

    5/

    RT

    RT

     

     

    说明书

    一份

     

     

    产品简介:

    植物原生质体是指脱去全部细胞壁由质膜包被的具有生命活力的裸露细胞。它具有细胞生命特征和全能型,是细胞无性系变异和突变体筛选的重要来源,同时也是植物遗传工程的理想受体和遗传改良的理想材料。酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶能降解细胞壁成分,去除细胞壁,即可得到原生质体。试剂盒配套的酶混合物是纤维素酶R-10和离析酶R-10的混合物,优化的酶配比能很好地消化植物细胞壁,提取到良好的植物原生质体。

    按照每次使用5 ml酶消化体系计算,本试剂盒可用于40次酶消化反应。本试剂盒每个5 ml反应体系可处理0.1 g左右的拟南芥叶片(约10~15叶片),操作较好的情况下每5 ml体系可获得约50-70万个原生质体(不同植物不同操作会有一定的差异),可满足约25-70个样品的原生质体质粒转染操作(按照每样1-2万个细胞计算)。

    本试剂盒不含有原生质体转化试剂,需要转化请参见植物原生质体转化试剂盒(RTU4092 )。

    贮存和效期:

       按照温度贮存,有效期一年。

    试剂盒常温运输。

    使用说明:

       需要准备的材料(试剂盒不提供):

       平头镊子;一次性刀片;50ml离心管;1.5ml离心管;水浴锅

    一、原生质体分离:

    即用型酶溶液配制

     

    5 ml配制量

    溶液I

    2.5 ml

    酶混合物

    0.095

    55℃处理10分钟,间歇混匀,冷却到常温后加入以下试剂

    还原剂

    2.5 μl

    50mg/ml BSA

    0.1 ml

    灭菌水

    定容至5 ml

    注:溶液I容易被微生物污染,使用时须严格按照无菌操作规范进行或者适当分装后使用。

    55℃处理能灭活核酸酶和蛋白酶并促进酶的溶解;

    即用型酶溶液现用现配,不建议配制后冻存后再使用;

    溶解好的正常酶溶液应为澄清棕黄色溶液,如使用纯度不好的酶,溶液为不溶解的乳白色悬浊液,不能使用。

    1. 酶解:

    取生长状态良好的叶片切成0.5-1 mm的小条,按照0.1 克叶片(拟南芥约15-20个叶片)加5 ml即用型酶溶液的比例迅速将切割好的叶片小条浸泡于酶溶液中,避光,无需震荡,常温酶解3小时,间歇混匀。

    注:酶解时间与叶片种类,叶片生长状态有关,请根据实验需要适当调整酶解时间。如条件允许,可以使用微型真空泵抽真空30 min,以使酶溶液更好地进入细胞间隙。酶溶液变为绿色表明有原生质体已经开始分离,拟南芥原生质体大小约为30-50 μm,显微镜镜检后确定是否分离。无须等原生质体完全释放出来后再进行后续操作的。如果消化时间过长,也会对原生质体产生一定的负面影响。

      2. 漂洗:

            取适量溶液II-5×W5 Solution,用超纯水稀释为1×W5 Solution。

     

    1×W5 Solution

    组份

    50 ml配制量

    溶液II-5×W5 Solution

    10 ml

    灭菌水

    40 ml

    酶解后加入等体积的1×W5 Solution,如使用5 ml酶解体系,加入5 ml 1×W5 Solution,轻柔混匀。

    3. 过滤:

    用孔径70 μm筛网过滤步骤2中的溶液,去除未消化的叶片,收集滤出液于50 ml离心管中。

    4. 第一次收集:

    滤出液100g常温离心 2分钟,尽量去除上清。

    5. 第二次收集:

    加入2-5 ml 1×W5 Solution重悬原生质体,冰浴30分钟,原生质体在重力作用下可以沉降到离心管底部,尽量吸除上清,收集原生质体。(如果发现原生质体沉降的速度比较慢或者得率比较低,也可以考虑常温100 g离心1-2 min收集原生质体)。

    6. 重悬:

    小心去除上清溶液,不要触动原生质体沉淀,沉淀重悬于1 ml溶液III中即为原生质体溶液。(可以根据原生质体数量调整溶液III的加入体积,使得原生质体密度为2×105/ml或更高)。

    注:制备好的原生质体可以在4oC或冰浴保存至少24 h。

     



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