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RTD6135 RealPAGE Bis-Tris预制胶(用于Blue/Clear非变性电泳)
 产品货号: RTD6135
 产品名称: RTD6135 RealPAGE Bis-Tris预制胶(用于Blue/Clear非变性电泳)
 产品价格/规格: 10板/盒 1000元
 产品说明书: 暂无
 更新时间: 2020-10-22
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    RealPAGE Bis-Tris预制胶(用于Blue/Clear非变性电泳)

           RealPAGE Bis-Tris Precast Gelsfor Blue/Clear Native PAGE 

    货品规格:

    货号

    名称

    分离范围

    规格

    保存

    RTD6135-0312

    3-12% RealPAGE Bis-Tris 预制胶(12 孔)

    30-10000 kD

    10

    4

    RTD6135-0416

    4-16% RealPAGE Bis-Tris 预制胶(12 孔)

    15-1000 kD

    10

    4

    产品简介:

    Blue/Clear Native PAGE(BN/CN-PAGE)是一种从生物样品(质膜,胞浆等)中分离分子量10 kD-10000 kD 范围的蛋白质复合物的电泳技术。其原理是用温和去污剂(如 DDM,digitonin)将蛋白复合体从细胞膜中以近似天然的状态分离出来,Blue Native PAGE (BN-PAGE)是用考马斯亮蓝 G-250 代替 SDS与蛋白结合而使其带负电荷,根据蛋白分子量不同在 PAGE胶中得到分离;Clear Native PAGE(CN-PAGE)是电泳缓冲液中不加入任何染料,电泳中始终保持蛋白的天然电荷和活性状态,然而,其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外,BN-PAGE由于考马斯亮蓝G-250存在,使蛋白都覆盖上负电荷,可以分离碱性蛋白(pI>7);而CN-PAGE只适合于酸性蛋白(pI<7)的分离。

    本产品可以用于分离分子量在 10 kD-10000 kD 的蛋白复合体,样品可以来于胞浆、细胞总裂解液、细胞膜、线粒体膜和叶绿体膜等。电泳后可直接用于考染、银染、Western 杂交、SDS-PAGE电泳、蛋白纯化、蛋白活性检测等分析实验,也可直接用于电洗脱制备蛋白。

    ● 运输和贮存:

    本产品常温运输;凝胶4-8℃贮存,不要冷冻;有效期6个月。

    使用说明:

    . 样品制备:

       该试剂盒不含样品制备的相关试剂,样品具体制备方法参考Blue Native PAGE. Wittig I, Braun H, Schagger H. Nature Protocols. Vol 1,No 1,418,2006.

    https://www.nature.com/articles/nprot.2006.62

    . 电泳:

    2.1 拆开预制胶包装,将预制胶安装在合适的电泳槽中。

    2.2 准备电泳缓冲液:

    10×BN/CN电泳缓冲液稀释10倍即配成1×BN/CN电泳缓冲液。

    2.2.1 CN-PAGE电泳:

    内槽缓冲液(阴极缓冲液)和外槽缓冲液(阳极缓冲液)均直接使用1×BN/CN电泳缓冲液进行电泳。

    2.2.2 BN-PAGE电泳:

    外槽缓冲液使用1×BN/CN电泳缓冲液,内槽缓冲液按照下表配制:

     

    1×蓝色阴极缓冲液

     

    150 ml

    10×BN/CN电泳缓冲液

    15 ml

    0.4% G-250 染料(电泳用)

    0.75 ml

    超纯水

    定容至150 ml

    2.3准备样品:

    2.3.1 CN-PAGE电泳:

    总体积

    10 μl

    蛋白样品

    x μl

    4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液

    2.5 μl

    超纯水

    补至10 μl

     

    不要加热

    2.3.2 BN-PAGE电泳:

    总体积

    10 μl

    10 μl

     

    含去垢剂样品*

    不含去垢剂样品

    蛋白样品

    x μl

    x μl

    4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液

    2.5 μl

    2.5 μl

    5% G-250染料(蛋白上样)

    0.25-1 μl

    0.1 μl(终浓度0.05%)或不加

    超纯水

    补至10 μl

    补至10 μl

     

    不要加热

    不要加热

    * 含去垢剂样品中染料加入按照以下原则:

    样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/4

    例如样品中DDM终浓度为1%,则需要G-250终浓度为0.25%。10 μl蛋白样品中需要加5% G-250染料0.5 μl。

    2.4电泳过程;

    2.4.1 CN-PAGE电泳:

    电泳内外槽均使用1×BN/CN电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×BN/CN电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔),轻轻拨出预制胶梳子,用1ml吸头冲洗加样孔3次,随后在电泳槽外槽加入适量的1×BN/CN电泳缓冲液,冰浴电泳,。

    电泳条件(一板胶)

    CN-PAGE电泳

    恒电流

    起始电压

    结束电压

    电泳时间

     

    10 mA

    70-90 V

    280-300 V

    1-1.5 h

    冰浴电泳

    2.4.2 BN-PAGE电泳:

    BN-PAGE电泳外槽使用1×BN/CN电泳缓冲液;内槽开始电泳使用的是1×蓝色阴极缓冲液,冰浴电泳,等待电泳指示前沿到达凝胶1/3处时,将电泳缓冲液更换为1×BN/CN电泳缓冲液,继续后续电泳,因为过多染料会影响蛋白在凝胶中的迁移以及蛋白后续的转膜实验。


    BN-PAGE电泳条件(一板胶)

    恒电流

    起始电压

    电泳时间

    缓冲液

     

    10 mA

    80-110 V

    20-25 min

    1×蓝色阴极缓冲液

    冰浴电泳

                   指示前沿至凝胶三分之一处,更换内槽缓冲液为1×BN/CN 电泳缓冲液

    恒电流

    继续电泳时间

    结束电压

    电泳总时间

    缓冲液

     

    10 mA

    60-70 min

    不要超过500 V

    1.5- 2 h

    1×BN/CN电泳缓冲液

    冰浴电泳


    . 缓冲液配方:

    3.1  10×BN/CN电泳缓冲液

    终浓度

    组份

    500 ml

    0.15 M

    Bis-Tris

    15.7

    0.5 M

    Tricine

    44.8

     

    超纯水

    定容至500 ml

    彻底溶解,测定pH应为7.0左右,不要调节pH。

    3.2  0.4% G-250 染料(电泳用)

        100ml:0.4克考马斯亮蓝G-250,溶于100 ml超纯水中,漩涡搅拌2-3小时,至染料彻底溶解,4℃贮存。

    3.3  4×BN/CN 蛋白上样缓冲液

    组成:200mM Bis-Tris,40%甘油,200 mM NaCl,0.04%丽春红S  pH7.0

    顺序

    终浓度

    原料

    50 ml

    1

    200 mM Bis-Tris

    粉末

    0.418

    2

    超纯水

     

    20 ml

     

     

     

    pH9.4

    3

    HCl

     

    200 μl

     

     

     

    调节pH7.1 左右

    4

    40% 甘油

    甘油

    25

    5

    200 mM NaCl

    粉末

    0.58

    6

    0.04% 丽春红S

    粉末

    20 毫克

    7

    超纯水

     

    定容至 50 ml

     

     

     

    最终pH7.0 25

    3.4  5% G-250 染料(上样用)

        组成: 5% G-250,500 mM 6-氨基己酸

        50 ml:称取2.5克考马斯亮蓝G-250,3.28克6-氨基己酸溶于50 ml超纯水中,漩涡搅拌2-3小时,至染料彻底溶解,4温度贮存。

    实验示例:



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