10×BN转膜缓冲液

● 简介：

10×BN转膜缓冲液（10×Blue Native Transfer Buffer）适用于BN蛋白电泳后凝胶上非变性蛋白的转膜。本转膜液配制便捷，稀释后无需调节pH值，pH约为7.5-7.7。该缓冲液最终可配成10升即用型1×缓冲液（根据需求补加甲醇）。

● 保存和运输：

粉末装常温保存，常温运输，两年有效；配成10×转膜缓冲液后4℃贮存，一年有效；加入甲醇的即用型转膜缓冲液4℃贮存，一个月有效。

● 配制方法：

将10×转膜缓冲液粉末全部溶解于1升超纯水中，彻底溶解，即配成10×转膜缓冲液。

根据下表配制成1×即用型转膜缓冲液

注：转膜缓冲液中加入甲醇对蛋白有固定作用，转膜分子量较大的蛋白少加或不加甲醇，转膜分子量较小的蛋白要加至多20%的甲醇。非变性蛋白的转膜可以不加甲醇。

● 使用方法：

1. BN电泳介绍：

Blue Native PAGE（BN-PAGE）是一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离分子量10 kD-10 M kD 范围的蛋白质复合物的电泳技术。其原理是用温和去污剂(如 DDM，digitonin)将蛋白复合体从细胞膜中以近似天然的状态分离出来，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考马斯亮蓝 G-250 代替 SDS与蛋白结合而使其带负电荷，根据蛋白分子量不同在 PAGE胶中得到分离。BN-PAGE由于考马斯亮蓝G-250存在，使蛋白都覆盖上负电荷，可以分离碱性蛋白（pI＞7）。BN电泳可以选择Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒(U型板3-12%预制胶，通用型)（货号：RTD6139-0312或RTD6139-0416）

2. 电泳后凝胶预处理（可选步骤）：

凝胶浸泡于适量1×即用型BN转膜缓冲液（加终浓度0.1% SDS）中，摇床慢摇10分钟。

注：凝胶浸泡在含SDS缓冲液中，能让蛋白带上更多的负电荷，有利于蛋白的转膜。

3. 转膜：

3.1转膜方法：BN电泳后的转膜建议用湿转法。

3.2膜的选择：BN电泳转膜必须使用PVDF膜，不能用NC膜（NC膜会与考马斯亮蓝G-250不可逆结合，很难清除干净）。根据蛋白大小选择膜的孔径。一般说来，大于20 kD蛋白选择0.45 μm孔径，低于20 kD选择0.22 μm孔径。PVDF膜使用前要用无水甲醇润湿活化。

3.3 三明治结构：转膜三明治结构与传统转膜相同，即根据“黑胶白膜”制作三明治，即膜置于转膜夹芯正极一侧，凝胶置于转膜夹芯负极一侧，这样凝胶上带负电荷的蛋白才能转移到膜上。

蛋白转膜三明治制作：

负极（电转夹黑色面）-海绵垫-1层1 mm厚度滤纸-凝胶-膜-1层1 mm厚度滤纸-海绵垫-正

极（电转夹白色面）

3.4 转膜条件：

由于在非变性条件下，不同蛋白的空间结构，聚合状态，电荷数量都有不同，以下转膜条件仅供参考，客户针对自己的目的蛋白，最好经过1-2次预实验后，确定最佳的转膜条件。

4. 洗膜：

PVDF膜用无水甲醇清洗10分钟，彻底去除蓝色G250。

5. 进行后续WB操作：封闭-一抗-二抗-检测。