细胞膜红色荧光染色试剂盒（DiI）

● 产品介绍：

细胞膜红色荧光染色试剂盒(DiI)，Cell Plasma Membrane Staining Kit with DiI (Red Fluorescence)是一种以DiI为荧光探针，能够快速灵敏地对细胞膜进行红色荧光染色标记的试剂盒。

DiI在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。DiI被激发后可以发出橙红色的荧光，DiI和磷酯双层膜结合后的激发光谱和发射光谱参考上图。其中，最大激发波长为549nm，最大发射波长为565nm。

本试剂盒如果用于流式细胞仪，每个样品的检测体系体积为0.5 ml时，可以进行200次检测；96孔板每孔检测体系的体积为100 μl时可以进行1000次检测。

● 产品组成：

● 贮存：

DiI（400×） -20℃避光保存，一年有效。染色缓冲液可以4℃贮存。

● 使用说明：

1. 细胞膜染色工作液制备：

细胞膜染色工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔的细胞膜染色工作液分别为1~2ml、0.5~1ml、300~500μl和50~100μl；对于流式细胞样品，每个样品的细胞膜染色工作液为0.5ml；对于切片，可以根据切片大小，每个切片使用100-200μl的细胞膜染色工作液。

注：不同细胞的最佳染色浓度略有不同，细胞膜染色工作液的最终浓度建议根据不同细胞系和实验体系进行优化，可在1:100-1:400之间进行调整。

2. 悬浮活细胞染色：

2.1 加入适当体积的细胞膜染色工作液重悬细胞，使其密度为1×10⁶/ml左右。

2.2 37℃避光孵育细胞5-20 min，不同的细胞最佳孵育时间不同。以5 min作为初始孵育时间，根据实际所用的细胞优化染色时间，以得到最佳的荧光染色效果。

2.3 500×g常温离心5 min。

2.4 吸除上清液，缓慢加入37℃预热的细胞培养液重悬细胞。

2.5 用细胞培养重复漂洗沉淀一次。

2.6 流式细胞仪检测，或将细胞封片观察，封片时请避免使用含有甘油或其它有机物的封片剂，否则会影响染色并增加荧光背景，可以直接用PBS封片，在荧光显微镜下观察。

3. 贴壁活细胞染色：

3.1 将贴壁细胞种于细胞培养皿、多孔细胞培养板或者细胞爬片上。

3.2 吸除细胞培养液，用PBS洗涤细胞2次。

3.3 加入适当体积的细胞膜染色工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。

3.4 37℃避光孵育细胞5-20 min，不同的细胞最佳培养时间不同。以5min作为初始孵育时间，根据实际所用的细胞优化染色时间，以得到最佳的荧光染色效果。

3.5 吸除细胞膜染色工作液，用PBS洗涤2次，然后加入37℃预热的细胞培养液即可在荧光显微镜下观察。

4. 固定后细胞或切片的染色：

注：DiI不建议用于固定后细胞或组织的染色，因为细胞固定后影响了细胞膜的结构，不能准确反映荧光标记位置。以下步骤仅供参考：

4.1. 使用4%多聚甲醛固定液进行固定。

4.2 吸除固定液，用PBS洗涤细胞3遍。

4.3 使用配制在PBS中的0.1% Triton X-100进行通透，常温10 min。然后用PBS洗涤细胞3遍。

4.4按照免疫染色的方法进行抗体的孵育或用其它染料进行染色。注意：抗体孵育步骤中的封闭液、抗体稀释液及洗涤液不能含有去垢剂。

4.5加入适当体积的细胞膜染色工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞或样品。

4.6 37℃避光孵育5-20 min，最佳染色时间需要根据自己的实验条件摸索，以达到最佳的荧光染色效果。

4.7吸除细胞膜染色工作液，用PBS洗涤2-3次，随后即可在荧光显微镜下观察。

● 实验示例：

操作程序：293细胞调整密度1×10⁵/ml，接种到6孔板中，培养30小时；去除培养基，PBS漂洗一次；33342染色37度10分钟，去除33342染色液，加1.5 ml PBS，观察拍照（40×）（图A）；去除PBS，DiI染色，37度10分钟，去除DiI染色液，加1.5ml PBS，观察拍照（40×）（图B）