Hoechst 33258染色液（Hoechst Stain Solution,10 μg/ml）

●  产品组成：

● 产品简介：

Hoechst 33258也称bisBenzimide H 33258或HOE 33258，分子式为C₂₅H₂₄N₆O·3HCl，分子量为533.88，CAS Number 23491-45-4。Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低，常用于细胞凋亡检测，染色后可用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33258也用于普通的细胞核染色、DNA染色。

Hoechst 33258和Hoechst 33342相比，Hoechst 33342对细胞的毒性作用更小一些，33258穿透能力较33342弱，染活细胞时容易被"泵出"，也就是拒染。所以一般来说Hoechst 33258用于细胞固定后再染色，而Hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色。

Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm，Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm， 最大发射波长为461nm。

本Hoechst 33258染色液为即用型，可直接用于固定细胞或组织的细胞核染色，也可直接用于活细胞或组织的细胞核染色

● 贮存：

-20℃避光保存，一年有效。

● 操作步骤：

一.固定后的细胞样品染色：

1. 贴壁细胞：

1.1.1 取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用无菌的PBS洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，生长至50%-80%满度。

1.1.2刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5 ml固定液，固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。

1.1.3去尽固定液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床或手动晃动。

1.1.4加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光染色10-15分钟，手动晃动数次。

1.1.5去尽染色液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床或手动晃动。

1.1.6滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。

1.1.7 荧光显微镜使用紫外激发，可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm左右，发射波长460nm左右。

注：荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。

2.悬浮细胞：

1.2.1 500 g（2400 rpm，下同）离心收集凋亡处理后细胞样品于1.5 ml离心管内，加入0.5 ml固定液，缓缓悬起细胞，常温固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。

1.2.2离心去尽固定液，用PBS洗两遍，每次3分钟，洗涤期间手动晃动数次。

1.2.3 细胞沉淀中加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光染色10-15分钟，手动晃动数次。

1.2.4 离心收集沉淀，重悬于100 μl PBS中。

1.2.5 取5 μl抗荧光淬灭封片液于载玻片上，加入等体积步骤1.2.4染色后细胞重悬液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。

1.2.6 荧光显微镜下紫外激发，可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350 nm左右，发射波长460 nm左右。

注：荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。

二.活细胞染色：

2.1 加入适当量Hoechst33258染色液，必须充分覆盖住待染色的样品，通常对于六孔板一个孔需加入1ml染色液，对于96孔板一个孔需加入100微升染色液。

2.2 在适宜于细胞培养的温度下培养20-30分钟。弃染色液，用PBS洗涤2-3次即可进行荧光检测。细胞发生凋亡时，在荧光显微镜下观察会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。

三. 实验示例:

操作流程： 胰酶消化液消化，计数2×10⁶/ml；500 g 3 min收集1.3 ml 293细胞；细胞沉淀中加入1 ml卡诺固定液，常温固定10 min；1×PBS漂洗两次；细胞沉淀中加入200 μl Hoechst染色液（10 μg/ml）；37度避光染色10 min； 离心后细胞沉淀重悬于100 μl 1×PBS中；取5 μl细胞悬液滴于载玻片上，加5 μl 抗荧光淬灭剂，封片观察。