PPA，Plant Tissue Culture Preservative Agents  

PPA –植物组织培养抗菌保护剂

使用操作说明

产品名称:PPA- Plant Tissue Culture Preservative Agents

（植物组织培养抗菌保护剂）

货号：PPA001-50ml

保存条件：4℃

运输条件：常温运输

性状：无色至琥珀色透明液体

pH 值：3.8

有效期：见瓶身标签说明

产品描述：

1.    PPA是一种热稳定的抗菌剂，用于植物组织培养中植物的微生物污染防治与清除；

2.   在合理的使用剂量下，PPA是一种非常有效的植物组培抗菌剂与保护剂，不会对植物的生长（如种子萌发，愈伤增殖、再生等）产生任何影响，可视为培养基标准配方成份；

3.   PPA主要用于预防和消除来自空气、水源或者人体接触等外界因素导致的植物组培过程中的微生物污染，同时，对于植物内生菌也同样具有非常好的抑制效果；

4. PPA广泛适用于绝大多数被子植物和裸子植物，但是不推荐用于蕨类植物、藻类等水生植物；

5.   PPA具有热稳定性，能直接加入培养基高温灭菌而不会影响使用效果，使用更加方便；

6.    PPA相对于常规抗生素而言，性价比更高。

作用机理：

PPA的活性成分能渗透细菌或者真菌细胞壁，抑制呼吸作用中三羧酸循环和电子传递链过程中关键酶的活性，同时也能阻断细菌和真菌吸收和利用培养基中单糖和氨基酸的过程，从而实现预防和清除植物组织培养过程中的微生物污染。

相对抗生素的优势：

1.    PPA能广泛抑制和清除细菌和真菌的污染，并防止真菌孢子的萌发；

2.    PPA是通过抑制多种酶的活性而达到抑菌效果，从而能避免耐药突变体的发生；

3.    PPA具有热稳定性，无需过滤灭菌，能直接加入培养基高温灭菌而不会影响使用效

果，使用更加方便；

4.    PPA性价比更高，可更加广泛的应用于更多的科学研究、作物育种、组培苗工厂化

生产中。

以下操作说明是针对大多数情况下的常规使用说明，必要时，可根据具体植物样本情况进行适当调整。

1.    常规用量：

一般推荐使用使用浓度为 0.05%-0.2%（1L 培养基中加入 0.5-2 ml PPA）;

愈伤增殖，器官形成，胚性组织发育等使用浓度为 0.05%-0.075%（1L 培养基中加入 0.5-0.75 ml PPA）。

说明：

(a) 含有 PPA的培养基无需在超净工作台中分装，在培养基凝固以后将培养瓶/皿盖子盖好即可。如使用自动灌装系统，建议在灌装前后将分装管用高压灭菌热水处理；

(b) 如果培养基储存液保存在无菌容器中并未经污染的情况下，加入 PPA配制的培养基无需再次过滤或者高温灭菌。如果是营养培养基，如含有 200 mg/L 甚至更高浓度氨基酸或者蛋白质的培养基，建议过滤灭菌。

2.    植物内生菌污染处理：

(a) 种子：PPA不推荐用于直接处理含有大量的细菌或真菌孢子的种子灭菌，对于种子离体萌发，建议先采用传统方法消毒，然后置于含 2-3% PPA的全培养基础盐溶液中，轻轻搅拌 4-12 小时，此过程千万不能添加 Tween20 和调节 pH，处理完成以后直接插入含有 PPA (草本植物 0.05-0.1%，木本植物 0.2%)的培养基里；

(b) 外植体：以 1cm 外植体为例，将外植体置于含 4-5% PPA的全培养基础盐溶液中，轻轻搅拌 4-12 小时，此过程千万不能添加 Tween20 和调节 pH，处理完成以后直接插入含有 PPA (草本植物 0.05-0.1%，木本植物 0.2%)的培养基里；

(c) 对于块茎，球茎和鳞状物的观赏植物样本：将其整体放入传统消毒剂中搅拌消毒处理以后，用水冲洗干净，将材料切成薄片，置于含 4-5% PPA的全培养基础盐培养液中，轻轻搅拌 4-12 小时，此过程千万不能添加 Tween20 和调节 pH，处理完成以后无需冲洗直接插入含有 0.1-0.2%的 PPA的培养基里进行培养。

3.   如果厚的外植体、污染严重的植株、种子等样本经过以上处理仍得不到理想效果，可尝试以下操作：

(a) 将材料浸泡在水中持续搅拌处理(松软组织搅拌 1 小时，硬实组织搅拌 2 小时)；

(b) 将材料在含 50%的 PPA全培养基础盐溶液中搅拌处理 5-10 分钟，此过程千万不能添加 Tween20 和调节 pH；

(c) 无需冲洗，将处理过的材料直接加入到培养基中即可。对于真菌污染，可在培养基中加入适当浓度的 PPA。对于真菌细菌混合性污染，建议在培养的第一个月的培养基中加入 0.05%-0.2%的 PPA。

4.    严重污染材料污染去除与抢救（重污染不超过一周）：

(a) 将污染的材料至于流水中用软刷刷洗，然后置于含 50% PPA的无菌水溶液中搅拌

5-15 分钟，对于细菌或者混合性污染，建议使用 100% PPA与 0.6 g/L 的柠檬酸无菌水溶液按 1：1 混合的低 pH(2.8-3.2)的酸性溶液处理；

(b) 处理后的材料无需清洗，直接插入含 0.05%-0.25 的 PPA的培养基中培养至少一个月以上，其中前 10 天需要弱光培养；对于一些真菌、孢子和细菌污染隐藏较深，PPA无法接触到的部位，建议在初步的清洗以后，将材料切开，然后再放入含 50% PPA的无菌水溶液中搅拌 5-15 分钟处理。

5.    农杆菌的去除：

共培养以后，将样本用无菌水清洗，然后将样本浸没在 100% PPA（补充 4X 的培养基盐溶液）中处理 2 分钟，取出后用无菌纸吸干后并置于常用抗性培养基中培养，3 周后，更换到只含有 0.05%-0.075% PPA (无常用抗生素)的培养基中培养。

使用注意事项：

1. 在所有 PPA消毒处理外植体的过程中，尽量保证容器的体积足够大，并使外植体材料所有面积与含 PPA 的处理溶液充分接触，以保证消毒效果；

2. 如果外植体出现高度氧化现象，不要扔弃，大约 50%的外植体在 4-6 周内即可恢复；

3. 50% PPA的处理溶液可以重复使用但是不推荐，因为使用次数和效果受外植体的体积与接种密度的影响。将 50% PPA的处理溶液保存在 4oC可适当延长其活性。

4. 如果 50% PPA溶液处理效果不理想，可采用 100% PPA溶液进行处理，处理方法相同，但使用次数不得超过 10 次。

安全说明：

1. 虽然 PPA是无毒性的，但是在使用过程中还需尽量避免直接与人体皮肤等直接接触，建议使用时佩戴手套，保持空间空气流通，如不慎吸入，先马上因大量纯净水后立即就医，如不慎入眼，立刻用大量水冲洗眼睛 15 分钟，用肥皂清洗 PPA接触过的皮肤部位；

2.  含 PPA的培养基垃圾处理与常规培养基处理方法相同。