超低分子量蛋白Marker V（3.5-42 kD）（非预染）

Ultra Low Molecular Weight Protein Marker V（3.5-42 kD）

Ver. 750271-2.0

RTD6113    20次（100 μl）

● 贮存、运输及效期：

  -20℃保存；湿冰运输；有效期1年。

● 贮存缓冲液成分：

65 mM Tris-HCl (pH 7.0), 20% Glycerol, 还原剂, 2% SDS, 0.005% 溴酚蓝。

● 产品简介：

   本产品包含8种低分子量蛋白质，分子量范围为3.5-42 kD，通过 Tris-Tricine-SDS-PAGE电泳并经考马斯亮蓝染色后可见分子量大小为3.5，4.5，8.5，14.4，17，21，30，42 kD的条带。

以每次上样5 μl计算，该产品可以使用20次。

● 使用说明：

1. 第一次收到该产品，常温融化后，彻底混匀，离心快甩10 Sec将溶液完全收集到管底，-20℃贮存；

2. 使用该产品时，常温解冻后轻轻混匀或用移液枪缓慢吹打均匀；

3. 从原液中吸取所需的上样量至新的微量离心管中；

4. 95-100°C下加热 5 min，使蛋白质完全变性；

5. 低速离心快甩10 Sec后，取 3-5 μl上样电泳；

一. 制胶：

多肽电泳建议使用Tris-Tricine-SDS-PAGE系统来分离蛋白，该系统可以分离1-100 kD的蛋白质（最优分离2.5-30 kD）。客户可以使用Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶快速制备及电泳试剂盒

（含预染Marker）（货号：RTD6121）或Tris-Tricine-PAGE凝胶制备及电泳试剂盒（多肽变性电泳）（货号：RTD6122）进行Tricine电泳，方便快捷。或者根据以下程序制备凝胶，先配制分离胶，聚合后再配制夹层胶，最后配制浓缩胶，3种胶的制胶体积比约为4.5:1.5:1.5。

1.1 配制分离胶：

1.1.1 按照表一将不同体积的分离胶组份加入到小烧杯中混合。

表一  （一块1 mm 厚度小板胶用量）

注：如非必须，不要使用1.5mm厚度的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。

1.1.2 加入10%APS和TEMED，立即混匀以使溶液混匀。

1.1.3 在玻璃板中灌入分离胶溶液，然后轻轻覆盖一层1-3 cm的无水乙醇，使凝胶表面保持平整。

1.1.4 静置10-20分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。分离胶37℃约10分钟，25℃约15分钟，18℃ 约20分钟可以聚合。

1.2 配制夹层胶：

1.2.1 去除覆盖在分离胶上的醇，用滤纸将残留的醇吸去。

1.2.2 按照表一将不同体积的夹层胶组份加入到小烧杯中混合。

1.2.3 加入10%APS和TEMED，立即混匀使溶液混匀。

1.2.4 在玻璃板中灌入适量夹层胶溶液，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5 cm即可，然后在溶液上轻轻覆盖一层1-3cm的无水乙醇，使凝胶表面保持平整。注：此溶液为过量，请勿全部注入。

1.2.5 静置20-30分钟，待夹层胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。夹层胶37℃ 20分钟，25℃ 25分钟，18℃ 约30分钟可以聚合。

1.3 配制浓缩胶

1.3.1 去除覆盖在夹层胶上的乙醇，用滤纸将残留的醇吸去。

1.3.2 按照表一将不同体积的浓缩胶组份加入到小烧杯中混合。

1.3.3 加入10%APS和TEMED，立即混匀，以使溶液充分混匀。

1.3.4 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

1.3.5 静置20-40分钟装待凝胶聚合。注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。浓缩胶37℃ 20分钟，25℃ 30分钟，18℃ 40分钟可以聚合。

二. 电泳：

2.1 电泳缓冲液配制：

  电泳前，将10×阳极缓冲液（Cat No:AB080）和10×阴极缓冲液（Cat No:CB010）用蒸馏水稀释成1×缓冲液备用。

2.2 样品处理：

  待上样的检测样品与2×Tricine上样缓冲液(Cat:TP050)等体积混合，95℃处理5分钟后上样。蛋白Marker一般已经含有上样缓冲液，预染Marker不能加热处理，混匀后直接上样，非预染Marker一般需要95℃处理5 min后上样。

2.3 电泳：

  将电泳槽的外槽加入1×阳极缓冲液，内槽加入1×阴极缓冲液，轻柔拔出梳子，将Marker或蛋白样品加入点样孔，稳压电泳（电泳条件参考下表）

三. 凝胶检测：

3.1 凝胶染色（FastBlue蛋白染色液）：

3.1.1将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中,用适量蒸馏水漂洗，去除胶表面的SDS，残余SDS会导致染色液出现沉淀。

3.1.2 弃水，加入适量染色液（以刚刚覆盖过胶面为适)，摇床上常温摇动，根据下表确定染色时间。

3. 1.3 摇床上摇动至所有条带清晰可见。

3. 1.4 蒸馏水摇动漂洗脱色1-2次，每次5-10分钟，至凝胶背景干净。

3. 1.5 收集用过的染色液，可以重复使用2-3次。

凝胶也可以使用常规考马斯亮蓝染色液（配方7）和脱色液（配方8）进行染色和观察。需要注意的是，常规染色和脱色方法需要较长时间，小肽由于长度较短，和凝胶结合不紧密，长时间在溶液中浸泡容易从凝胶中脱离。FastBlue蛋白染色液（货号：RTD6202）除具有染色快，无毒，灵敏性高等特点外，还能对小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脱色中从凝胶中脱离，是常规染色液的理想替代品。

3.2 转膜：

多肽电泳后转膜选择孔径0.22 μm PVDF膜（用前用甲醇处理润湿）或0.22 μm NC膜。

3.2.1 半干转：使用伯乐Trans-Blot Turbo半干转机器请选择配套的5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液（货号：RT5030），推荐转膜条件:一板小型凝胶(8×10 cm)恒流,1.3 A,10-15 min。

3.2.1 湿转：湿转转膜缓冲液(25 mM Tris,192 mM Glycine, 0.01%SDS，20% Methanol,pH~8.3），可以选择10×Tris-甘氨酸转膜缓冲液（货号：TB1040）。推荐转膜条件：恒流200 mA  40-60 min。

四.小分子蛋白质SDS-PAGE电泳试剂配制：