超低分子量蛋白Marker IV(3.3-45kD)
●产品编号及规格:
RTD6127 10T(50μl)
● 储存条件: -20℃保存,开封后有效期12个月。
● 产品简介:本产品包含2种多肽和3种低分子量蛋白质组成,分子量范围为3.3kD-45kD。可以用来判断 SDS-PAGE上多肽和小蛋白的分子量。
|
● 使用说明:
第一次收到该产品,室温融化后,彻底混匀,离心快甩将溶液完全收集到管底;本产品每次使用前,要95℃加热处理5分钟。
一. 制胶:
I 配制分离胶
1.按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA(19:1)、凝胶缓冲液和乙二醇加入到小烧杯中混合。
2.加入10%APS和TEMED,立即混匀5-10秒,以使溶液充分混匀。
3.在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液,然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3 cm的水层,使凝胶表面保持平整。
4.静置5-10分钟,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
表一 (一块0.75mm mini胶用量)
|
分离胶
|
浓缩胶
|
|
18%T, 5%C /6.0 ml
|
5%T, 3.3%C/2 ml
|
40% PAA(19:1)
|
2.7 ml
|
/
|
40% PAA (29:1)
|
/
|
0.25 ml
|
4×多肽电泳凝胶缓冲液
|
1.5 ml
|
0.5 ml
|
乙二醇(电泳级)
|
1.8 ml
|
/
|
ddH2O
|
/
|
1.25 ml
|
10%APS
|
50-65 μl
|
20 μl
|
TEMED
|
6 μl
|
2 μl
|
注:如非必须,不要使用1.0mm和1.5mm的凝胶,尽量使用厚度0.75mm的凝胶,这样会减少电泳后染色和脱色的时间。
II 配制浓缩胶
去除覆盖在分离胶上的水层,用滤纸将残留的水吸去。
1.按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA(29:1)和凝胶缓冲液加入到小烧杯中混合。
2.加入10%过硫酸铵和TEMED,立即混匀5-10秒,以使溶液充分混匀。
3.将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。
4.静置20-30分钟装待凝胶聚合
二. 电泳:
1. 取一管分装好的Marker样品,彻底融化,95℃加热处理5分钟,充分混匀后备用。1mm厚度凝胶10齿梳子推荐上样5μl,其他厚度和梳子调整后上样。
2. 电泳前,将10×Tris-Tricine-SDS电泳缓冲液(Cat No:CB010)用蒸馏水稀释成1×缓冲液备用。将电泳槽的内外槽加入1×缓冲液,轻柔拔出梳子,将Marker或蛋白样品(样品已经过2×Tricine上样缓冲液[Cat No:TP050]处理)加入点样孔,根据表二条件进行电泳,至蓝色指示前沿至分离胶3/4位置时即可停止电泳。整个电泳过程大约需要2-3个小时。注:如果电泳时间过短,染色时,指示前沿容易遮挡小于5kd的小肽。
表二 多肽电泳条件
恒电压
|
150 V
|
起始电流
|
45-55 mA
|
结束电流
|
10-15 mA
|
电泳时间
|
2-3小时
|
三. 染色
根据常规实验步骤,用配方5和6(表三)进行染色和观察。如果使用配方5进行染色时效果不好或考虑其毒性,请选择本公司的FastBlue蛋白染色液(Cat No:RTD6202),该产品能在5分钟之内完成蛋白的染色,不至于小肽在染色和脱色中从凝胶中脱离,是常规染色液的理想替代品。
表三 小分子蛋白质SDS-PAGE电泳试剂配制
1. 40%PAA(29:1)(配制浓缩胶)
Cat No:AC2914
丙稀酰胺 38.67g
甲叉双丙稀酰胺 1.33g
用ddH2O溶解后定容至100
ml,过滤后使用。
贮存:4℃避光保存
|
2. 40% PAA(19:1) (配制分离胶)
Cat No:AC1914
丙稀酰胺 38 g
甲叉双丙稀酰胺 2 g
用ddH2O溶解后定容至100
ml,过滤后使用。
贮存:4℃避光保存
|
3. 4×多肽电泳凝胶缓冲液(配制凝胶用)
[3MTris; 0.4% SDS; pH8.45]
Cat No:GB010
Tris碱 36.3 g;
ddH2O 80ml
0.4 g SDS或4 ml 10%SDS
用HCl调pH值至8.45;用ddH2O定容至100 ml
贮存:4℃
|
4. 10×Tris-Tricine-SDS电泳缓冲液
[1MTris;1MTricine ;1% SDS; pH 8.3]
Cat No:CB010
Tris碱 121.14g
Tricine 179.2g
SDS10g
用ddH2O溶解,定容至1000ml(不用调pH)。
贮存:4℃
注:使用前稀释成1×缓冲液使用
|
5. 染色液
冰醋酸 100 ml
甲醇 450 ml
考马斯亮蓝G-250 0.25
g
水 450 ml
6. 脱色液
冰醋酸 100ml
水 900ml
|
7. 2×Tricine蛋白样品上样缓冲液(10ml)
Cat No:TP050
1ml 1MTris-Cl pH6.8
2.4ml 甘油
0.8g SDS
0.31g DTT(或者400μl β-巯基乙醇)
2mg 考马斯亮蓝G-250
用灭菌ddH2O定容至10ml
混匀分装-20℃贮存备用
|
超低分子量蛋白MarkerIV附加说明
由于小肽的氨基酸数目较少,表观分子量受氨基酸种类影响很大,同一小肽在不同的电泳系统中表现为分子量大小可能不一样。超低分子量蛋白Marker IV中的倒数第二条带即为这种情况。在使用4×多肽电泳凝胶缓冲液加乙二醇的凝胶系统中(RTD6127附带说明书系统),表观分子量为10KD(上图左);而在使用超低分子量试剂盒系统(RTD6120)电泳时,表观分子量为5.5KD(上图右)。
多肽电泳配套试剂
使用RTD6127超低分子量蛋白Marker IV(3.3-45kD)蛋白Marker产品发表部分文章列表:
1. [2021 IF=2.99] Purifcation,
characterization, and action mechanism of plantaricin DL3, a novel bacteriocin
against Pseudomonas aeruginosa produced by Lactobacillus plantarum DL3 from
Chinese Suan Tsai.
Author: Xinran Lv, Yang Lin ,Yu Jie, Mengtong Sun, Bolin Zhang,Fengling
Bai,Hongfei Zhao,Jianrong Li
Marker: RTD6127,超低分子量蛋白Marker
IV(3.3-45 kD)
Journal: European Food Research and Technology. Vol
244, pages 323–331 (2018)
Institution:College of Biological
Science and Biotechnology, Beijing Forestry University
Paper link:https://link.springer.com/article/10.1007/s00217-017-2958-3