蛋白PAGE凝胶快速制备试剂盒（红色上层胶）
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货号
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说明
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规格
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RTD6133
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蛋白PAGE凝胶快速制备试剂盒（红色上层胶）
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45-90板胶
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Protein PAGE Gel Fast Preparation Kit （Red Stacking Gel）
● 货品内容：
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组份
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货号
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名称
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规格
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保存
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1
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AC2914-01
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40%PAA（29：1）
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100 ml
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4℃
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2
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RTD6133-UA
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红色上层胶溶液A（2×）
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50 ml
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4℃
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3
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RTD6133-LB
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下层胶溶液B（2×）
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180 ml
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4℃
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4
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RTD6133-SP
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改良型促凝剂
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8 ml
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4℃，配制后-20℃贮存
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5
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1018210CM
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1.0 mm玻璃板/梳子套装
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2套
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RT
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6
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说明书
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-
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● 产品简介：
该产品利用聚丙烯酰胺凝胶电泳原理，采用合理设计的预混合配方和配制流程，可在30-50分钟内配制得到高质量的聚丙烯酰胺凝胶，用于变性和非变性蛋白凝胶电泳。本产品可以配制常用下层胶浓度6%、8%、10%、12%和15%，可以满足绝大多数蛋白电泳需求。
本试剂盒可配制45-90块常规大小（8×10cm）的PAGE胶，具体凝胶数量和凝胶浓度、厚度以及凝胶的大小有关。按照10%凝胶，大小8×10cm，可以配置0.75 mm厚度凝胶约90板，1.0 mm厚度凝胶约68板，1.5 mm厚度凝胶约45板。
● 运输和贮存：
本产品常温运输；组份按照标签温度贮存；有效期一年。
● 特点：
1. 方便：红色上层胶，方便上样；
2. 安全：不用接触有毒粉末；不用单独添加TEMED；
3. 兼容性广：制胶溶液中不含SDS，可用于非变性电泳（Native-PAGE）；
4. 配备1.0 mm厚度玻璃板和电泳梳子，方便实验。
● 使用说明：
一 凝胶制备：
1.1参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
1.2 根据下表参考选择合适的凝胶浓度：
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下层胶（下层胶）浓度
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最佳分离范围
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6%
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50-350 kD
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8%
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35-300 kD
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10%
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20-150 kD
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12%
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15-100 kD
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15%
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10-80 kD
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1.3配制一块常用凝胶(10×8 cm)所需下层胶和上层胶体积(下层胶按6厘米高度计算，上层胶按1.5厘米高度计算，均含约0.2 ml的冗余量)参见下表。
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凝胶厚度
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下层胶体积
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上层胶体积
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0.75 mm
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4.0 ml
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1.0 ml
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1.0 mm
|
5.0 ml
|
1.5 ml
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1.5 mm
|
8.0 ml
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2.0 ml
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注：下层胶体积已包含适量冗余，请勿全部用于灌制下层胶，以免灌胶时上层胶高度不够。
1.4配制下层胶：
参考下表，配制不同浓度的下层胶。适当混匀后倒入到制胶模具中，用蒸馏水或异丙醇或无水乙醇封住液面，直至下层胶凝固充分后再进行PAGE上层胶的配制。通常25℃ 10-40分钟内下层胶会凝固。注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。上层胶25℃ 10-15分钟可以聚合凝固；18℃ 35-40分钟可以聚合凝固。
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组份
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不同凝胶体积对应各组份的取样量（ml）
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6％ 胶
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5
ml
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10
ml
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15
ml
|
20
ml
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H2O
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1.7
|
3.4
|
5.1
|
6.8
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下层胶溶液B（2×）
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2.5
|
5.0
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7.5
|
10.0
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40％ PAA（29:1）
|
0.75
|
1.5
|
2.25
|
3.0
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改良型促凝剂
|
0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
|
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8％ 胶
|
5 ml
|
10 ml
|
15 ml
|
20 ml
|
|
H2O
|
1.45
|
2.9
|
4.35
|
5.8
|
|
下层胶溶液B（2×）
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
|
40％ PAA（29:1）
|
1.0
|
2.0
|
3.0
|
4.0
|
|
改良型促凝剂
|
0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
|
|
10％ 胶
|
5
ml
|
10
ml
|
15
ml
|
20
ml
|
|
H2O
|
1.2
|
2.4
|
3.6
|
4.8
|
|
下层胶溶液B（2×）
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
|
40％ PAA（29:1）
|
1.25
|
2.5
|
3.75
|
5.0
|
|
改良型促凝剂
|
0.05
|
0.1
|
0.1
|
0.2
|
|
12％ 胶
|
5
ml
|
10
ml
|
15
ml
|
20
ml
|
|
H2O
|
0.95
|
1.9
|
2.85
|
3.8
|
|
下层胶溶液B（2×）
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
|
40％ PAA（29:1）
|
1.5
|
3.0
|
4.5
|
6.0
|
|
改良型促凝剂
|
0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
|
|
15％ 胶
|
5
ml
|
10
ml
|
15
ml
|
20
ml
|
|
H2O
|
0.575
|
1.15
|
1.725
|
2.3
|
|
下层胶溶液B（2×）
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
|
40％ PAA（29:1）
|
1.875
|
3.75
|
5.625
|
7.5
|
|
改良型促凝剂
|
0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
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1.5配制上层胶：
按照如下表格配制4% PAGE上层胶。下层胶灌注后，去除压胶溶液，配制好的上层胶紧贴玻璃板均匀轻柔注入到下层胶上，小心插入梳子等待凝固。
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组份
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不同凝胶体积对应各组份的取样量（ml）
|
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4％上层胶（上层胶）
|
2
ml
|
4
ml
|
6
ml
|
8
ml
|
|
H2O
|
0.78
|
1.56
|
2.34
|
3.12
|
|
红色上层胶溶液A（2×）
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1.0
|
2.0
|
3.0
|
4.0
|
|
40％ PAA（29:1）
|
0.2
|
0.4
|
0.6
|
0.8
|
|
改良型促凝剂
|
0.02
|
0.04
|
0.06
|
0.08
|
注：红色上层胶缓冲液(2×)使用前须摇匀。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。
上层胶25℃ 20-25分钟可以聚合凝固；18℃ 35-40分钟可以聚合凝固。
二 电泳：
2.1 SDS-PAGE变性电泳：
2.1.1电泳缓冲液配制：
将5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液干粉（自备，组份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
2.1.2 样品处理：融化-混合-变性-上样
5×蛋白上样缓冲液（变性，还原）常温数分钟解冻后轻轻摇匀，以确保溶液混合均匀；将缓冲液与蛋白样品按照1：4的比例混匀，如8 μl样品加入2 μl
5×上样缓冲液；将蛋白样品置于95℃中加热5-10分钟；蛋白样品加入凝胶加样孔内电泳。
2.1.3 电泳过程；
在电泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，用1ml吸头彻底冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
SDS-PAGE电泳条件
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恒电压
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起始电流（一板胶）
|
结束电流（一板胶）
|
电泳时间
|
适用条件
|
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150V
|
35-40
mA
|
15-20
mA
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55
+ min
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最佳电压，最优的分辨率
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200V
|
45-55
mA
|
20-25
mA
|
45+
min
|
节省时间
|
|
225V
|
40-50
mA
|
15-20
mA
|
35+
min
|
|
250V
|
65-75
mA
|
20-25
mA
|
30+
min
|
|
300V
|
70-80
mA
|
25-35mA
|
25+
min
|
最省时间
|
2.2 非变性电泳（Native PAGE）：
2.2.1电泳缓冲液配制：
将5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液干粉（自备，组份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。
2.2.2 样品处理：融化-混合-上样
5×非变性非还原蛋白上样缓冲液常温数分钟解冻后轻轻摇匀，以确保溶液混合均匀；将缓冲液与蛋白样品按照1：4的比例混匀，如8 μl样品加入2 μl
5×上样缓冲液；蛋白样品加入凝胶加样孔内电泳。注：非变性电泳样品不能加热处理。
2.2.3 电泳过程；
在电泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，用1ml吸头彻底冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
Native PAGE电泳条件
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恒电压
|
起始电流
|
结束电流
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电泳时间
|
适用条件
|
|
推荐电压
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150V
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25-35/板胶
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5-10 mA/板胶
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60 + min
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最佳电压，最优的分辨率
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三. 染色：
1. 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白染色液或常规考马斯亮蓝染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），条带1-2分钟即可见。
2. 摇床常温摇动10-15分钟至条带清晰可见。
3. 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1-2次蒸馏水，摇床常温摇动10-15分钟至背景干净。
4. 观察保存结果。