蓝色预染超低分子量蛋白质Marker（3.3-31
kD）
Blue Ultra Low Molecular Weight Protein
Marker (3.3-31 kD) Ver750260-1.0
●产品编号及规格：
RTD6152 10次（100 μl）
● 贮存、运输及效期：
-20℃贮存；湿冰运输；有效期12个月。
● 产品简介：
本产品包含预染的3种多肽和2种低分子量蛋白质组成，分子量大小范围为~3. 3，~6.5，~14.4，~20.1，~31
kD。可以用于直接观察蛋白质电泳状况以及清晰地判断Western Blot的转膜效果。经Tricine-甘油SDS-PAGE凝胶电泳时以及转移到PVDF或NC膜上可看到清晰的5条蓝色的蛋白条带。以每次上样10 μl计算，该产品可以使用20次。
● 使用说明：
第一次收到该产品，常温融化后，彻底混匀，离心快甩将溶液完全收集到管底。本产品为即用型，溶化后既能使用，不能95℃加热处理。
一. 制胶：
先配制分离胶，聚合后再配制夹层胶，最后配制浓缩胶，3种胶的制胶体积比约为4.5:1.5:1.5（注：表一中夹层胶和浓缩胶配制体积是过量的，制胶时不要全部加入）。
1.1 配制分离胶：
1.1.1 按照表一将不同体积的组份加入到小烧杯中混合。
1.1.2 加入10%APS和TEMED，立即混匀以使溶液混匀。
1.1.3 在玻璃板中灌入分离胶溶液，然后轻轻覆盖一层1-3 cm的无水乙醇，使凝胶表面保持平整。
1.1.4 静置10-20分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。分离胶37℃约10分钟，25℃约15分钟，18℃ 约20分钟可以聚合。
1.2 配制夹层胶：
1.2.1 去除覆盖在分离胶上的醇，用滤纸将残留的醇吸去。
1.2.2 按照表一将不同体积的组份加入到小烧杯中混合。
1.2.3 加入10%APS和TEMED，立即混匀使溶液混匀。
1.2.4 在玻璃板中灌入适量夹层胶溶液，然后在溶液上轻轻覆盖一层1-3cm的无水乙醇，使凝胶表面保持平整。注：此溶液为过量，请勿全部注入。
1.2.5 静置20-30分钟，待夹层胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。夹层胶37℃ 20分钟，25℃ 25分钟，18℃ 约30分钟可以聚合。
1.3 配制浓缩胶
1.3.1 去除覆盖在夹层胶上的乙醇，用滤纸将残留的醇吸去。
1.3.2 按照表一将不同体积的组份加入到小烧杯中混合。
1.3.3 加入10%APS和TEMED，立即混匀，以使溶液充分混匀。
1.3.4 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
1.3.5 静置20-40分钟装待凝胶聚合。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。浓缩胶37℃ 20分钟，25℃ 30分钟，18℃ 40分钟可以聚合。
表一
（一块1 mm 厚度小板胶用量）
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分离胶
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夹层胶
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浓缩胶
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16.5%T6%C/4.5
ml
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10%T3%C/2
ml
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5%T3%C/2
ml
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49.5%T
3%C
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/
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0.4
ml
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0.2
ml
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49.5%T
6%C
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1.5
ml
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/
|
/
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4×凝胶缓冲液
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1.125
ml
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0.5
ml
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0.5
ml
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50%甘油（v/v）
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0.9
ml
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-
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-
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ddH2O
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0.95
ml
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1.1
ml
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1.3
ml
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10%APS
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~45
μl
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~20
μl
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~20
μl
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TEMED
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~4.5
μl
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~2
μl
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~2
μl
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注：如非必须，不要使用1.5mm厚度的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。
二. 电泳：
2.1 电泳缓冲液配制：
电泳前，将10×阳极缓冲液（Cat No:AB080）和10×阴极缓冲液（Cat No:CB010）用蒸馏水稀释成1×缓冲液备用。
2.2 样品处理：
待上样的检测样品与2×Tricine上样缓冲液(Cat:TP050)等体积混合，95℃处理5分钟后上样。蛋白Marker一般已经含有上样缓冲液，预染Marker不能加热处理，混匀后直接上样，非预染Marker一般需要95℃处理5 min后上样。
2.3 电泳：
将电泳槽的外槽加入1×阳极缓冲液，内槽加入1×阴极缓冲液，轻柔拔出梳子，将Marker或蛋白样品加入点样孔，稳压电泳（电泳条件参考下表）
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浓缩胶
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恒压 30 V
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35-45 min
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夹层胶
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恒压 80 V
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30-40 min
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分离胶
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恒压 120 V
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80-100 min
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待指示前沿到达分离胶下沿时,即可停止电泳，电泳时间总计2-4小时
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三. 凝胶检测：
注：多肽染色可以用配方7和8（表二）进行染色和观察。如果使用该配方进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择FastBlue蛋白染色液（Cat
No：RTD6202），该产品能在60分钟之内完成蛋白的染色，不至于小肽在染色和脱色中从凝胶中脱离，是常规染色液的理想替代品。
3.1
染色（以FastBlue蛋白染色液染色为例）：
3.1.1
将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中,用适量蒸馏水漂洗，去除胶表面的SDS，残余SDS会导致染色液出现沉淀。
3.1.2
弃蒸馏水，加入适量染色液（以刚刚覆盖过胶面为适),摇床上常温摇动，根据下表确定染色时间。
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待检测蛋白量
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染色时间
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＞1 μg
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~5分钟
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100 ng-1 μg
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~10分钟
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10 ng-100 ng
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~60分钟
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3.2 转膜：
多肽电泳后转膜选择孔径0.22 μm PVDF膜（用前用甲醇处理润湿）或0.22
μm NC膜。
3.2.1
半干转：
使用伯乐Trans-Blot Turbo半干转机器请选择配套的5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液（货号：RT5030），推荐转膜条件:一板小型凝胶(8×10
cm)恒流,1.3 A,10-15 min。
3.2.1
湿转：
湿转转膜缓冲液(25 mM Tris,192 mM Glycine, 0.01%SDS，20%
Methanol,pH~8.3），可以选择10×Tris-甘氨酸转膜缓冲液（货号：TB1040）。推荐转膜条件：恒流200
mA 40-60 min。
四.小分子蛋白质SDS-PAGE电泳试剂配制：
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1.
49.5%T3%C PAA(Cat:PS080)
丙稀酰胺 48 g
甲叉双丙稀酰胺 1.5 g
用ddH2O溶解后定容至100
ml，
过滤后使用。
贮存：4℃
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2.
49.5%T6%C PAA（Cat:PI080）
丙稀酰胺 46.5 g
甲叉双丙稀酰胺 3 g
用ddH2O溶解后定容至100
ml，
过滤后使用。
贮存：4℃
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3.
4×凝胶缓冲液(Cat:GB010）
[4
M Tris; 0.4% SDS; pH8.45]
Tris碱 48.4 g
ddH2O 80 ml
0.4
g SDS或4 ml 10％ SDS
用HCl调pH值至8.45
25℃.
用ddH2O定容至100
ml；贮存：4℃
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4.
10×阳极缓冲液（Cat:AB080）
[2
M Tris pH8.9]
Tris碱 121.1 g
ddH2O 400 ml
用HCl调pH值至8.9
用ddH2O定容至500
ml
贮存：4℃
注：使用前稀释成1×阳极缓冲液使用。
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5.
10×阴极缓冲液（Cat:CB010）
[1M
Tris;1M Tricine;1% SDS;pH 8.3]
Tris碱 121.14 g
Tricine 179.2 g
SDS
10 g
用水溶解，定容至1000
ml(不用调pH)。
贮存：4℃
注：使用前稀释成1×阴极缓冲液使用
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6.
2×Tricine多肽上样缓冲液(变性,还原)
(Cat:TP050)
2
ml 1M Tris-Cl pH6.8
5
g 甘油
0.2
g SDS
0.2
g DTT（或者400 μl β-巯基乙醇）
4
mg 考马斯亮蓝G-250
用灭菌ddH2O定容至10
ml
混匀分装-20℃贮存备用
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7. 染色液
冰醋酸 100 ml
考马斯亮蓝G-250 0.25 g
水 900 ml
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8. 脱色液
冰醋酸 100 ml
水 900 ml
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9.
50%甘油
甘油 50 ml（63克）
超纯水 定容到100
ml
贮存：4℃
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实验示例：
多肽电泳配套试剂