6%Tris-醋酸-SDS-PAGE电泳试剂盒（变性电泳，手灌胶）
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货号
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名称
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规格
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RTD6162
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6%Tris-醋酸-SDS-PAGE电泳试剂盒（变性电泳，手灌胶）
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10次
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● 产品组成：
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货号
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名称
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规格
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贮存
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RTD6162-UA
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上层胶溶液A
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15
ml
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4℃
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RTD6162-UB
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彩色上层胶溶液B
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15
ml
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4℃
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RTD6162-LA06
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下层胶溶液A 6%
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30
ml
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4℃
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RTD6162-LB
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下层胶溶液B
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30
ml
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4℃
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TA1510
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400×抗氧化剂
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15
ml
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4℃
(配制后-20℃贮存)
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TA050
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10×Tris-醋酸-SDS电泳缓冲液(变性电泳,溶液型）
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500
ml
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RT
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PL080-01
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5×MonoClolor蛋白上样缓冲液 (变性，还原)
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1 ml
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-20℃
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RTD6202-02
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FastBlue蛋白快速染色液
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500 ml
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RT
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TA5030P
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10×Tris-醋酸转膜缓冲液（湿转，粉末型）
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500
ml
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RT
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AP020P
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10%
APS（干粉）
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5
ml
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RT
(配制后-20℃贮存)
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TA0761-01
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TEMED
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0.5
ml
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4℃ 避光
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说明书
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一份
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-
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● 产品简介：
Tris-醋酸-SDS-PAGE凝胶电泳适合于分离高分子量蛋白，可以有效分离50-500 kD范围内蛋白；电泳体系呈中性，能有效提高蛋白的稳定性；电泳缓冲体系中加入抗氧化剂，整个电泳过程都在还原条件下进行，有效防止二硫键的形成。
该试剂盒包含凝胶制备、蛋白上样、蛋白电泳、蛋白染色及转膜所需的全部试剂。试剂盒配套的制胶溶液，可以配制10板厚度1mm凝胶（面积8×10 cm），分离胶浓度为6%，可以有效分离50-500 kD范围内蛋白。配好的凝胶浓缩胶为红色，方便上样。本试剂盒用于蛋白变性还原电泳，不适用于蛋白非变性电泳。
按照一次实验电泳一板凝胶计算，本试剂盒可以使用10次。
● 贮存、运输及效期：
按照标签温度贮存；试剂盒常温运输；有效期一年。
● 使用说明：
一. 实验准备：
1.1 10%APS为干粉，用前加入5 ml超纯水震荡彻底溶解，适量分装后取一管使用。溶解后的APS -20℃贮存。
1.2 400×抗氧化剂为干粉，用前加入15 ml超纯水震荡彻底溶解后使用，已经溶解的400×抗氧化剂-20℃贮存。
二. 凝胶配制：
2.1参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
2.2 根据下表配制凝胶：
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下层胶配方
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上层胶配方
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胶厚度
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下层胶溶液B
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下层胶溶液A
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10%APS
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TEMED
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胶厚度
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彩色上层胶溶液B
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上层胶溶液A
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10%APS
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TEMED
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0.75 mm
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2 ml
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2 ml
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40 μl
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4 μl
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0.75 mm
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0.5 ml
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0.5 ml
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10 μl
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1 μl
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1.0 mm
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2.5 ml
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2.5 ml
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50 μl
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5 μl
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1.0 mm
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0.75 ml
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0.75 ml
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15 μl
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1.5 μl
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1.5 mm
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4 ml
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4 ml
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80 μl
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8 μl
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1.5 mm
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1 ml
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1 ml
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20 μl
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2 μl
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2.2.1 取等体积下层胶溶液B 和下层胶溶液A ，各
2.0/2.5/4.0 ml，混匀；
2.2.2混合溶液中加入 40/50/80 μl的10%APS和4/5/8
μl的TEMED，轻轻混匀，将混匀后的溶液注入制胶玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5 cm即可；
注意：此溶液为过量，请勿全部注入。
2.2.3 沿玻璃板缓慢加入适量灭菌水或无水乙醇覆盖于下层胶之上，待下层胶凝固后，倒去上层水或乙醇；
注意：当水（乙醇）和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固；25℃时10-15分钟可以聚合。
2.2.4 取等体积彩色上层胶溶液B和上层胶溶液A ，各
0.5/0.75/1.0 ml，混匀；
2.2.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的10%APS和1/1.5/2
μl 的TEMED，轻轻混匀，插入梳齿；
2.2.6 待上层胶凝固后 （约20-40
min），拔去梳齿即可用于电泳。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。
上层胶25℃ 20-25分钟可以聚合；18℃ 35-40分钟可以聚合。
三. 电泳：
3.1 准备1×电泳缓冲液：
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总体积
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1000
ml
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10×Tris-醋酸-SDS电泳缓冲液
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100 ml
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超纯水
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900 ml
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3.1.1 外槽缓冲液：取适量体积1×电泳缓冲液用于外槽缓冲液。
3.1.2 内槽缓冲液：200 ml 1×电泳缓冲液中加0.5 ml 400×抗氧化剂，混合均匀后用于内槽缓冲液。
3.2准备上样样品：
注：表格以配制10 μl样品为例，其他体积按照比例调整。
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总体积10 μl
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组份
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还原样品
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蛋白样品
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x μl
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5×MonoClolor蛋白上样缓冲液 (变性，还原)
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2 μl
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超纯水
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补至10 μl
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95℃ 10分钟
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3.3电泳过程；
在电泳槽的内槽加入内槽缓冲液（已加入抗氧化剂），让电泳缓冲液漫过加样孔，轻轻的拨出梳子，用1ml吸头冲洗加样孔3次；随后在电泳槽外槽加入适量的外槽缓冲液（不用添加抗氧化剂）。上样，电泳。
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恒电压
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起始电流
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结束电流
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电泳时间
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200
V
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65-75 mA/板胶
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35-55 mA/板胶
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50+min
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注：冰浴电泳（可选）
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四. 染色：
注：如果只是观察蛋白的分离情况，对凝胶进行染色。如果要后续进行WB实验，凝胶不要染色，进行步骤五。
4.1 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），摇床常温摇动，条带5-10分钟即可见（蛋白含量高于1
μg条带）。
4.2 摇床常温继续摇动15-30分钟至条带清晰可见。
4.3 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1-2次蒸馏水，摇床常温摇动10-15分钟至背景干净。
4.4 观察保存结果。
五. 转膜：
5.1 转印膜选择：
Tris-醋酸凝胶转膜可以使用NC膜和PVDF膜，需要选择0.45 μm孔径。PVDF膜使用前注意需要用甲醇润湿活化。
5.2 10×Tris-醋酸转膜缓冲液（溶液型）配制：
将10×Tris-醋酸转膜缓冲液（湿转，粉末型）粉末溶解于500 ml超纯水中，即配成500 ml 10×Tris-醋酸转膜缓冲液（溶液型），不要调节pH，pH~7.2。
5.3 准备1×转膜缓冲液：
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1×即用型转膜缓冲液 配制量 1升
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10×Tris-醋酸转膜缓冲液(溶液型)
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100
ml
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20-80 kD蛋白
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无水甲醇
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10%
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SDS
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0.05%
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＞80 kD蛋白
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无水甲醇
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10%（NC膜）
0-5%（PVDF膜）
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SDS
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0.1%
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超纯水
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定容至1升，不要调节pH，pH~7.2
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注：甲醇和SDS在转膜中有拮抗作用。甲醇使蛋白更加结合在膜上，而SDS让蛋白更加离开膜。因此对大蛋白转膜来说，多加SDS，少加甲醇；而对小蛋白转膜，多加甲醇，少加SDS。
5.4 转膜条件：
高分子量蛋白建议湿转。以下转膜条件仅供参考，客户针对自己的目的蛋白，最好经过1-2次预实验后，确定最佳的转膜条件。
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膜孔径
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蛋白大小
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稳流
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建议时间
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降温措施
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0.45 μm
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50-200 kD
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350 mA
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~60分钟
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需要
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0.45 μm
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高于200
kD
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350 mA
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~2-3小时
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需要
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六. 实验示例：
凝胶：6%Tris醋酸手灌胶
电泳：1×TAS 200V 70-42mA 55min；内槽加抗氧化剂
染色：FastBlue蛋白染色液染色 15 分钟
样品：4K-BME-细菌裂解物；K562-悬浮细胞RIPA提取总蛋白