植物总蛋白提取试剂盒-通用型

Plant Total Protein Isolation Kit（for general use）

● 产品组成：

● 产品简介

本产品能够有效裂解各种植物器官（如叶片，根，茎，果实，种子，花），去除各种植物样品（包括富含次生代谢物质和多糖多酚的植物）中常见的污染，如多糖，多酚，脂类，色素，次生代谢物等，得到的高纯度蛋白样品，可以用于SDS-PAGE凝胶电泳，Western印迹分析以及双向电泳（2D电泳）。

该试剂盒含有除丙酮外的其他所有试剂，使用方便，能在3小时内得到高纯度的蛋白样品。

按照每次提取使用0.7ml试剂B计算，该试剂盒可以至少使用20次。

●  使用方法：

实验准备材料：

液氮；研钵；1.5ml离心管；一次性注射器；丙酮；80%丙酮；70℃水浴锅；干浴器；冷冻离心机；制冰机；涡旋振荡器。

一. 样品破碎：

1.1 取植物样本，在液氮条件下，用研钵充分研磨成粉末。

关键步骤：此步骤非常重要，样本研磨越细越好，研磨不彻底会导致蛋白浓度偏低。

二. 沉淀杂质：

2.1 取1.5 ml离心管，加入1 ml即用型试剂A（按照下表配制），迅速将约0.1克粉末加入其中，漩涡混匀，RT 放置5分钟。

关键步骤：样品粉末量不能超过0.1克，否则将导致蛋白提取得率和纯度大大降低。

即用型试剂A-样本杂质去除剂配制

2.212000g4℃离心5分钟，去除上清，保留沉淀。

注：观察沉淀颜色，如沉淀颜色为绿色，继续步骤2.3；如沉淀颜色为浅色或白色，直接进行步骤2.4。

2.3 沉淀中加入1 ml即用型试剂A，漩涡混匀，RT放置5分钟，12000g4℃离心5分钟。

2.4 沉淀中加入1 ml 预冷的丙酮（自备，试剂盒不提供）和10 μl DTT溶液，漩涡震荡（此时溶液状态应为白色悬液），彻底重悬，12000g4℃离心5分钟，去除上清，收集沉淀。

2.5 快甩离心数秒，残留上清用移液器彻底吸弃，沉淀物通风晾干1-2分钟至沉淀干燥。

 关键步骤：沉淀不能过分干燥，否则会影响以下步骤蛋白的溶解性。

三. 蛋白粗提：

3.1 蛋白沉淀中加入0.7 ml 即用型试剂B（按照下表配制），漩涡震荡，彻底重悬沉淀（此时溶液状态为淡蓝色的悬浮溶液）；70℃水浴1小时，间歇混匀。

即用型试剂B-植物蛋白提取缓冲液配制：

3.212000g4℃离心10分钟，小心取上清（通常可取600 μl，溶液为淡蓝色）于1.5ml离心管中，不要吸取沉淀。

注：此步骤得到的蛋白溶液可以进行大多数蛋白实验，如WB。如要进行双向电泳（2D电泳）实验，继续以下步骤。

四. 蛋白纯化：

4.1 加入与上清等体积的试剂C（注：试剂C上层为保护相，应该吸取下部的淡黄色液体），剧烈颠倒震荡后常温放置1-2分钟，12000gRT 离心5分钟，溶液分成两层，上层溶液为蓝色，蛋白位于下层溶液中。

注：试剂C有腐蚀性，请在通风橱内操作，注意防护。

4.2 用一次性注射器小心吸取下层溶液（通常可取350 μl）于1.5 ml离心管中，加入等体积试剂D，剧烈颠倒混匀，12000gRT 离心5分钟，蛋白位于上层溶液中，收集上层溶液（通常可取150-200 μl）于1.5ml离心管中。

五. 蛋白沉淀：

5.1 蛋白溶液中加入5倍体积溶液E（注意是否已经按照标签所示加入甲醇），颠倒混匀，此时可见有絮状沉淀生产，-20℃ 沉淀30分钟。

    注：微量蛋白的提取可以-20℃过夜沉淀。

5.212000g4℃离心10分钟，收集蛋白沉淀，去除上清。

注：正常的蛋白沉淀接近无色，如颜色为褐色或淡黄色说明蛋白不纯，不能用于双向电泳实验。重复步骤3.1-5.2，直至蛋白沉淀接近无色。

5.3 沉淀中加入1ml 溶液E（注意是否已经按照标签所示加入甲醇），彻底重悬沉淀，12000rpm4℃离心5分钟，弃上清。

5.4 沉淀中加入1ml预冷的80%丙酮（自备，试剂盒不提供）和10 μl DTT，彻底重悬沉淀，12000g4℃离心5分钟，弃上清。

5.5 快甩离心数秒，残留上清移液器彻底吸弃，沉淀物通风晾干1-2分钟至沉淀干燥。

   关键步骤：沉淀不能过分干燥，否则不好溶解。

六. 蛋白溶解：

6.1 沉淀中溶解于适量PBS溶液或者适当体积样品缓冲液溶解，-20℃或-80℃贮存。

注： ① 如进行双向电泳，样品溶于双向电泳样品缓冲液中；如进行单向电泳，样品溶于1×SDS-PAGE 上样缓冲液中。

 ② 由于提取过程中使用了DTT，为了避免DTT对蛋白浓度测定的干扰，蛋白定量时尽量选择Bradford方法。