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柱式动物胞浆蛋白提取试剂盒(细胞样品,非变性提取,不含去垢剂)

柱式动物胞浆蛋白提取试剂盒(细胞样品,非变性提取,不含去垢剂)

产品编号:RTD8106

产品规格:50次

数量
价格 ¥300

柱式动物胞浆蛋白提取试剂盒(细胞样品,非变性提取,不含去垢剂)

(Column Animal Cells Native Protein Extraction KitDetergent-free)

货号

名称

规格

RTD8106

柱式动物胞浆蛋白提取试剂盒(细胞样品,非变性提取,不含去垢剂)

50





产品简介

蛋白提取过程中经常使用去垢剂裂解细胞,如NP-40,Triton X-100,SDS等。然而这些去垢剂会对提取的蛋白后续功能研究产生影响。如去垢剂会影响蛋白的荧光标记;高浓度的去垢剂会影响蛋白互作研究;阴离子去垢剂如SDS提取得到变性蛋白,不利于蛋白活性研究;含去垢剂的蛋白样品能与考马斯亮蓝G-250结合,影响Blue Native电泳的分离效果。

本试剂盒采用不含去垢剂的裂解缓冲液,在低渗透压条件下,使细胞充分膨胀,然后结合离心柱离心,有效破坏细胞膜,释放出细胞内蛋白,然后通过离心得到活性蛋白。另外,裂解缓冲液中也不含有还原剂如DTT和BME等,能有效保持蛋白的天然结构。

对于细胞样品,如果每个样品的数量为5×106个细胞,本试剂盒可以抽提50个样品。

使用该产品提取的蛋白可以用于普通非变性电泳(Laemmli系统)(货号:RTD6130,RTD6135)或Blue Native系统(货号:RTD6140)。

注:由于提取缓冲液的适用性,本试剂盒主要提取得到的是胞浆内的可溶性蛋白,对细胞膜蛋白,细胞器蛋白,细胞核蛋白提取效率不高,不建议使用。

● 产品组成

产品编号

名称

规格

贮存

RTD8106-01

非变性裂解缓冲液

25 ml

4℃

CD-50

离心柱套装

(包含离心柱和2ml连盖收集管)

50

RT

●  贮存、效期及运输:

按照标签温度贮存;有效期一年;常温运输。

用前必读:

1. 离心机请调整成RCF/g模式,按照离心力设置离心机(不要根据转速rpm模式设置),所有离心步骤都需要在4℃低温离心机中进行。

2. 溶液混匀后放置于冰上。将离心柱套入2 ml连盖收集管中,盖好管盖,放置于冰上预冷。

3. 蛋白提取推荐添加蛋白酶抑制剂(自备,试剂盒不提供),根据蛋白酶抑制剂母液浓度提前添加在裂解缓冲液中(添加时按照1:100添加,即1ml裂解缓冲液 添加10 μl抑制剂)。研究蛋白磷酸化,需要添加磷酸酶抑制剂(自备,试剂盒不提供)。

4. 蛋白定量推荐使用BCA方法,可以选择BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号:RTP7102)。

 

使用方法:

培养细胞活性蛋白提取:

1.1 即用型裂解缓冲液配制:

取适当体积的预冷裂解缓冲液,在使用前数分钟内加入1/100体积的蛋白酶抑制剂(100×)(自备,试剂盒不提供),如果进行蛋白磷酸化研究,需要加入1/100体积的磷酸酶抑制剂(100×)(自备,试剂盒不提供),随后立即放于冰上待用(30分钟内使用)。

按照下表大体估算裂解缓冲液使用体积:

细胞类型

培养器皿

细胞数量

细胞沉淀体积(PCV)(μl

裂解缓冲液(μl

悬浮细胞

 

2-5×106

20-50

200

 

5-10×106

50

500

贴壁细胞

96孔板

~1×105

调整细胞数目到2-5×106

200

24孔板

~5×105

调整细胞数目到2-5×106

200

6孔板

~2.5×106

~25

200

25cm2培养瓶

~2×106

~20

200

75cm2培养瓶

~8×106

~80

500

35 mm培养皿

~2×106

~20

200

60 mm培养皿

~5×106

~50

500

100 mm培养皿

~1.5×107

调整细胞数目到2-5×106

200

注: (二百万,2×106)HeLa细胞,其细胞沉淀体积(PCV,Packed Cell Volume)大约为20 μl。

1.2 准备细胞:

1.2.1 对于贴壁细胞:细胞用PBS漂洗一遍,弃PBS;再加入适量PBS,用细胞刮刀刮下细胞,或用0.02% EDTA(0.5 mM)溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧,并用移液器吹打下细胞。400 g(~2000 rpm) 4℃离心5 min收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞,以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

1.2.2 对于悬浮细胞:400 g(~2000 rpm)4℃离心5 min收集细胞,用PBS洗一遍,离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。

1.3 裂解细胞膜:

1.3.1细胞沉淀中加入准备好的裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),用移液器吹打重悬细胞沉淀,涡旋剧烈震荡30-60冰浴处理10分钟,间歇2-3次混匀。

注:裂解缓冲液使用推荐经验值:起始细胞数低于5×106加入 200 μl 裂解缓冲液,起始细胞数在5×106-1×107之间加入500 μl。如果细胞数目低于1×106或高于1×107,建议调整细胞数目在2-5×106范围内。

1.3.2 将细胞悬液转移到离心柱中,盖上管盖,16,000 g(~13000 rpm) 4℃离心1分钟,离心后可见收集管底部有沉淀形成。

     注:离心柱最大体积为600 μl;确保离心机转速可以在1分钟内升速到16000 g

   1.3.3 弃去离心柱,盖好2 ml收集管管盖,用1ml移液器轻柔吹打重悬收集管中的沉淀。

1.4 去除细胞核和未破碎的细胞:

将悬浮溶液16000 g(~13000 rpm) 4℃离心15分钟。

1.5 收集上清:

收集上清即为胞浆蛋白,其蛋白浓度约为0.5-2 μg/μl,不同细胞略有不同。

关键步骤:吸取上清时不要触及沉淀,甚至可以丢弃部分上清不吸取,以免上清中污染其他蛋白。

实验示例:

2.1 电泳检测:

5×106 K562细胞,400g 3min收集,PBS漂洗一次;加500 μl 即用型提取缓冲液(含蛋白酶抑制剂),震荡 60秒,冰浴10min;16000g 1min 过离心柱;重悬沉淀;4度 16000g 15 min,取上清即为胞浆活性蛋白。BCA测定蛋白浓度,蛋白得率2×108细胞提取蛋白量约1.5 mg。BN电泳(右图):RTD6140 配制10% BN胶。使用 4×BN蛋白上样缓冲液(货号:PL114)调整上样浓度为0.5μg/μl。1×蓝色阴极电泳缓冲液 200V 50min,更换为1×无色阴极缓冲液,电泳时间共93min,FastBlue蛋白染色液染色。变性电泳(左图):RealPAGE 4-18%预制胶,用RIPA提取总蛋白(RIPA-TP)做对照样品,使用 含BME上样缓冲液调整上样浓度为0.5μg/μl,200V 60min,FastBlue蛋白染色液染色。

2.2 WB检测:

1 样品:柱式动物胞浆蛋白提取试剂盒(RTD8106)提取K562总蛋白(活性提取);
            柱式动物总蛋白提取试剂盒(RTD8302)提取K562总蛋白(变性提取)
2 电泳:RealPAGE Tris-Gly预制胶4-15%,。非变性电泳:1×TG;变性电泳:1×TGS
3 转膜:0.22μm NC膜;伯乐Turbo半干转,滤布,一槽两胶,RealBlot快速半干转转膜缓冲液(RT5030),
             恒流2.5A 15min
4 封闭:Western快速封闭液(WR5020)快封10分钟
5 一抗:β-Tubulin 1:5000(RGT2130)RT 60min;二抗-羊抗鼠IgG-HRP 1:5000(HGM1060) RT 60min
6 RealECL发光液(EC2520) 曝光1S
右图:为同样样品变性电泳,同时转膜,背靠背孵育.
结论:
1 β-Tubulin可以作为Tris-甘氨酸非变性系统的对照,结果为多种聚体。
2 柱式动物胞浆蛋白提取试剂盒(RTD8106)可以很好地非变性提取可溶性蛋白
3 RTD6137 440kD可以转到膜上,作为分子量参照 


 
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