柱式动物胞浆蛋白提取试剂盒(细胞样品,非变性提取,不含去垢剂)

(Column Animal Cells Native Protein Extraction Kit，Detergent-free)

● 产品简介

蛋白提取过程中经常使用去垢剂裂解细胞，如NP-40，Triton X-100，SDS等。然而这些去垢剂会对提取的蛋白后续功能研究产生影响。如去垢剂会影响蛋白的荧光标记；高浓度的去垢剂会影响蛋白互作研究；阴离子去垢剂如SDS提取得到变性蛋白，不利于蛋白活性研究；含去垢剂的蛋白样品能与考马斯亮蓝G-250结合，影响Blue Native电泳的分离效果。

本试剂盒采用不含去垢剂的裂解缓冲液，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后结合离心柱离心，有效破坏细胞膜，释放出细胞内蛋白，然后通过离心得到活性蛋白。另外，裂解缓冲液中也不含有还原剂如DTT和BME等，能有效保持蛋白的天然结构。

对于细胞样品，如果每个样品的数量为5×10⁶个细胞，本试剂盒可以抽提50个样品。

使用该产品提取的蛋白可以用于普通非变性电泳（Laemmli系统）（货号：RTD6130，RTD6135）或Blue Native系统（货号：RTD6140）。

注：由于提取缓冲液的适用性，本试剂盒主要提取得到的是胞浆内的可溶性蛋白，对细胞膜蛋白，细胞器蛋白，细胞核蛋白提取效率不高，不建议使用。

● 产品组成

●  贮存、效期及运输：

按照标签温度贮存；有效期一年；常温运输。

● 用前必读：

1. 离心机请调整成RCF/g模式，按照离心力设置离心机（不要根据转速rpm模式设置），所有离心步骤都需要在4℃低温离心机中进行。

2. 溶液混匀后放置于冰上。将离心柱套入2 ml连盖收集管中，盖好管盖，放置于冰上预冷。

3. 蛋白提取推荐添加蛋白酶抑制剂（自备，试剂盒不提供），根据蛋白酶抑制剂母液浓度提前添加在裂解缓冲液中（添加时按照1:100添加，即1ml裂解缓冲液 添加10 μl抑制剂）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制剂（自备，试剂盒不提供）。

4. 蛋白定量推荐使用BCA方法，可以选择BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7102）。

● 使用方法：

一 培养细胞活性蛋白提取：

1.1 即用型裂解缓冲液配制：

取适当体积的预冷裂解缓冲液，在使用前数分钟内加入1/100体积的蛋白酶抑制剂（100×）（自备，试剂盒不提供），如果进行蛋白磷酸化研究，需要加入1/100体积的磷酸酶抑制剂（100×）（自备，试剂盒不提供），随后立即放于冰上待用（30分钟内使用）。

按照下表大体估算裂解缓冲液使用体积：

注： (二百万，2×10⁶)HeLa细胞，其细胞沉淀体积（PCV，Packed Cell Volume）大约为20 μl。

1.2 准备细胞：

1.2.1 对于贴壁细胞：细胞用PBS漂洗一遍，弃PBS；再加入适量PBS，用细胞刮刀刮下细胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。400 g（~2000 rpm） 4℃离心5 min收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

1.2.2 对于悬浮细胞：400 g（~2000 rpm）4℃离心5 min收集细胞，用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

1.3 裂解细胞膜：

1.3.1细胞沉淀中加入准备好的裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），用移液器吹打重悬细胞沉淀，涡旋剧烈震荡30-60秒，冰浴处理10分钟，间歇2-3次混匀。

注：裂解缓冲液使用推荐经验值：起始细胞数低于5×10⁶加入 200 μl 裂解缓冲液，起始细胞数在5×10⁶-1×10⁷之间加入500 μl。如果细胞数目低于1×10⁶或高于1×10⁷，建议调整细胞数目在2-5×10⁶范围内。

1.3.2 将细胞悬液转移到离心柱中，盖上管盖，16,000 g（~13000 rpm） 4℃离心1分钟，离心后可见收集管底部有沉淀形成。

     注：离心柱最大体积为600 μl；确保离心机转速可以在1分钟内升速到16000 g。

   1.3.3 弃去离心柱，盖好2 ml收集管管盖，用1ml移液器轻柔吹打重悬收集管中的沉淀。

1.4 去除细胞核和未破碎的细胞：

将悬浮溶液16000 g（~13000 rpm） 4℃离心15分钟。

1.5 收集上清：

收集上清即为胞浆蛋白，其蛋白浓度约为0.5-2 μg/μl，不同细胞略有不同。

关键步骤：吸取上清时不要触及沉淀，甚至可以丢弃部分上清不吸取，以免上清中污染其他蛋白。

二 实验示例：

2.1 电泳检测：

5×10⁶ K562细胞，400g 3min收集，PBS漂洗一次；加500 μl 即用型提取缓冲液（含蛋白酶抑制剂），震荡 60秒，冰浴10min；16000g 1min 过离心柱；重悬沉淀；4度 16000g 15 min，取上清即为胞浆活性蛋白。BCA测定蛋白浓度，蛋白得率2×10⁸细胞提取蛋白量约1.5 mg。BN电泳（右图）：RTD6140 配制10% BN胶。使用 4×BN蛋白上样缓冲液（货号：PL114）调整上样浓度为0.5μg/μl。1×蓝色阴极电泳缓冲液 200V 50min，更换为1×无色阴极缓冲液，电泳时间共93min，FastBlue蛋白染色液染色。变性电泳（左图）：RealPAGE 4-18%预制胶，用RIPA提取总蛋白（RIPA-TP）做对照样品，使用 含BME上样缓冲液调整上样浓度为0.5μg/μl，200V 60min，FastBlue蛋白染色液染色。

2.2 WB检测：

1 样品：柱式动物胞浆蛋白提取试剂盒（RTD8106）提取K562总蛋白（活性提取）；
            柱式动物总蛋白提取试剂盒（RTD8302）提取K562总蛋白（变性提取）
2 电泳：RealPAGE Tris-Gly预制胶4-15%,。非变性电泳：1×TG；变性电泳：1×TGS
3 转膜：0.22μm NC膜；伯乐Turbo半干转，滤布，一槽两胶，RealBlot快速半干转转膜缓冲液（RT5030），
             恒流2.5A 15min
4 封闭：Western快速封闭液（WR5020）快封10分钟
5 一抗：β-Tubulin 1:5000(RGT2130)RT 60min；二抗-羊抗鼠IgG-HRP 1:5000(HGM1060) RT 60min
6 RealECL发光液(EC2520) 曝光1S
右图：为同样样品变性电泳，同时转膜，背靠背孵育.
结论：
1 β-Tubulin可以作为Tris-甘氨酸非变性系统的对照，结果为多种聚体。
2 柱式动物胞浆蛋白提取试剂盒（RTD8106）可以很好地非变性提取可溶性蛋白
3 RTD6137 440kD可以转到膜上，作为分子量参照