PAGE胶蛋白微量回收试剂盒（货号：RTD8108）       

● 试剂盒组成：

● 运输、储存条件和效期：

常温运输，标签温度保存，有效期为一年。

● 产品简介及使用说明：

蛋白电泳不仅可用于检测蛋白质的相对分子质量，而且也是分离纯化蛋白质的重要工具之一，随着蛋白质技术的微量化，有必要从凝胶中回收蛋白质以用于制备抗体、免疫印迹、氨基酸组分分析或末端序列测定等，本产品就是专门为此用途开发的微量蛋白胶回收法，回收效率在50-80%。

按照每次使用400 μl 溶液A计算，试剂盒至少可以使用20 次。

● 使用方法：

1. 电泳：

按常规方法进行变性（SDS-PAGE）或非变性蛋白电泳（Native-PAGE）。

2. 切胶：

2.1 用手术刀片将铜染（货号：RTD6207）或锌染（货号：RTD6206）的胶块中含有目的条带的部分胶切下（尽可能地把多余的胶切除，否则会影响回收效率），放入1.5 ml的离心管中，用相应的消除液将胶中蛋白质条带脱色到胶体接近无色透明，超纯水漂洗凝胶两次，保留胶体进行步骤3。

2.2 由于考马斯亮蓝染色蛋白的特殊性，不建议考染后进行切胶操作。建议把样品分多孔上样，电泳后只切其中一个胶孔的胶条进行染色，然后将此胶条放回到在整体胶中原来的位置，通过显色胶条上的蛋白条带找到在未染色胶上对应区域，并切下胶体进行步骤3。

2.3 如不进行染色，可以使用预染Marker判断目的蛋白的位置进行切胶进行步骤3。但此方法缺点在于蛋白的位置难以精确判断。

3. 研磨处理：

3.1 称取1.5 ml离心管中胶块重量；用研磨杵充分将胶块压磨成尽可能细小的碎片。

3.2 即用型溶液A配制：

    根据溶液A的使用量配制即用型溶液A的体积。配制比例为：1 ml溶液A加入10 μl 1 M DTT溶液。

3.3根据胶块重量加入即用型溶液A，用研磨杵再次充分研磨，4℃摇床慢摇洗脱过夜（12-16小时）。

注：胶块重量和即用型溶液A体积大体按照1:4比例加入，如胶块100 mg加入400 μl即用型溶液A，溶液A使用量宁多勿少。洗脱时间与凝胶浓度，蛋白分子量大小有关，胶浓度越高，分子量越大，洗脱时间越长。

4. 过滤除胶：

用1 ml 的去尖吸头吸取混合物至过滤柱中（过滤柱放入收集管中），注意将碎胶一起吸入，溶液过多时可分次加入，12,000 rpm 离心2分钟，保留收集管中的滤出液（包含蛋白）。

5. 蛋白沉淀：

     5.1 将滤出液转移到1.5 ml离心管中，加入1/10体积的溶液B-助沉液，混匀，常温放置15 min。

     5.2 加入步骤5.1溶液1/4体积的溶液C-沉淀液，充分混匀后，冰浴15 min。

         注：加入溶液C后溶液变浑浊，需要彻底充分混匀。

5.3  4℃ 12,000 rpm离心10分钟，去除上清，保留蛋白沉淀。

   注：由于溶液B-助沉液的作用，此步骤得到管底很明显的蛋白沉淀物。

6. 蛋白漂洗：

6.1 蛋白沉淀中加入1 ml预冷的丙酮（自备，试剂盒不提供），彻底重悬沉淀，混匀，冰浴放置15 min。

6.2 4℃ 12,000 rpm离心10分钟，去除上清，保留沉淀。

    注：通过丙酮的漂洗，去除步骤5.3中蛋白沉淀中的非蛋白组份。

6.3 离心管快甩离心，用10 μl吸头将离心管中残余溶液彻底吸净，常温开口风干1-2分钟，待残留的液体挥发干净。

7. 蛋白贮存：

实验示例：