动物组蛋白提取试剂盒

(Animal Total Histone Extraction Kit)

● 产品简介

组蛋白（Histone）是指所有真核生物的细胞核中，与DNA结合存在的碱性蛋白质的总称，它和DNA共同组成核小体结构。它们是染色质的主要蛋白质组分，作为DNA缠绕的线轴，并在基因调控中发挥作用。组蛋白通常含有H1，H2A，H2B，H3，H4等5种成分。除H1外，其他4种组蛋白均分别以二聚体(共八聚体）相结合，形成核小体核心。DNA便缠绕在核小体的核心上。而H1则与核小体间的DNA结合。因此，一般认为组蛋白作为结构支持体的作用比其基因调节作用更为重要。组蛋白可受到甲基化、乙酰化、磷酸化、聚ADP核糖酰化，以及与泛醌(ubiquinone）相结合等几种类型的修饰。组蛋白的修饰与染色质结构的变化及基因活性的控制关系紧密。

该试剂盒采用优化配方，可以迅速从细胞或组织中提取组蛋白，同时配套有HDAC(Histone deacetylase，组蛋白去乙酰化酶)抑制剂，可以维持组蛋白酰基化水平。

对于细胞样品，如果每个样品的数量不超过一千万个（10⁷）细胞（细胞沉淀体积PCV 100 μl），本试剂盒可以抽提50个样品；对于组织样品，如果每个样品的重量不超过50 mg，本试剂盒可以抽提50个样品。每一千万细胞或100 mg组织提取的组蛋白含量约为0.4 mg。

● 产品组成

● 贮存条件和运输：

按照标签温度贮存，一年有效；试剂盒湿冰运输。

● 使用方法：

一 培养细胞组蛋白提取：

1.1 即用型裂解缓冲液配制：

常温融解试剂盒中的试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当体积的裂解缓冲液，在使用前数分钟内加入1/100体积的PMSF（100×）和1/50体积去乙酰化酶抑制剂（40×），配成

即用型裂解缓冲液，随后立即放于冰上待用。

1.2 准备细胞：

1.2.1 对于贴壁细胞：用PBS漂洗一遍，弃PBS；再加入适量PBS，用细胞刮刀刮下细胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。450 g 4℃离心5 min收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需要抽提的目的蛋白。

1.2.2 对于悬浮细胞：450 g 4℃离心5 min收集细胞，用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

1.3 按照下表加入各种试剂体积：

注：1×10⁷(一千万)HeLa细胞，其细胞沉淀体积（PCV，Packed Cell Volume）约为100 μl。

1.4 细胞裂解：

1.4.1第一次裂解：细胞沉淀中加入即用型裂解缓冲液（10倍PCV体积），用移液器吹打重悬细胞沉淀，不要涡旋震荡，把细胞沉淀完全悬浮并分散开,冰浴15分钟，间歇混匀。

1.4.2 第二次裂解：600 g 4℃离心5 min收集细胞，尽最大努力吸尽上清，细胞沉淀中加入即用型裂解缓冲液（5倍PCV体积）。

1.4.3 匀浆：用超声破碎细胞（推荐130W功率超声1分钟，超声2秒，停顿3秒）或用玻璃匀浆器冰浴匀浆5-10次或使用注射器用27G针头处理裂解物10-15次（货号：PE2719，蛋白提取针头套装）,以彻底裂解细胞，收集裂解混合物，冰浴处理15分钟。

1.4.4 4℃16,000g离心15分钟，去掉上清，保留沉淀。

1.5 细胞组蛋白提取：

    1.5.1 沉淀重悬于0.25 ml 提取缓冲液中，超声处理（推荐130W功率超声2分钟，超声2秒，停顿3秒），冰浴30分钟，间歇混匀。

注：超声处理为必须步骤，否则沉淀很难彻底溶解，大大降低组蛋白提取得率。

    1.5.2 4℃ 16000g 离心10分钟，收集组蛋白上清。

    1.5.3 即用型中和缓冲液配制：

        取适当体积的中和缓冲液，在使用前数分钟内加入1/100体积的PMSF（100×），1/40体积去乙酰化酶抑制剂和1/500体积 1M DTT，配成即用型中和缓冲液，随后立即放于冰上待用。

    1.5.4 组蛋白上清中加入0.3倍体积即用型中和缓冲液，混匀，即为组蛋白提取溶液。

注：组蛋白溶液电泳检测时，如果加入上样缓冲液后溶液变黄，加入1/10体积中和缓冲液将颜色调整为蓝色后再上样。

1.6 组蛋白贮存：

    组蛋白溶液-20℃贮存一周或-80℃长期贮存。

二 新鲜组织组蛋白提取：

2.1即用型裂解缓冲液配制：

常温融解试剂盒中的试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当体积的裂解缓冲液，在使用前数分钟内加入1/100体积的PMSF（100×）和1/40体积去乙酰化酶抑制剂，配成即用型裂解缓冲液，随后立即放于冰上待用。

2.2准备组织：

组织块迅速置于预冷的1×PBS 中，漂洗数次，滤纸吸干水分，将组织切成细小的组织块，称重组织，按照下表加入各试剂的量

注：50 mg新鲜组织相当于细胞沉淀体积（PCV，Packed Cell Volume）约为100 μl。

2.3 组织裂解：

2.3.1第一次裂解：组织中加入即用型裂解缓冲液（10倍PCV体积），用玻璃匀浆器冰浴匀浆10-20次,以彻底裂解细胞，收集裂解混合物，冰浴处理15分钟，间歇混匀。

       2.3.2 第二次裂解：4℃ 600 g离心5 min收集细胞，尽最大努力吸尽上清，细胞沉淀中加入即用型裂解缓冲液（5倍PCV体积）。

2.3.3用超声破碎细胞（推荐130W功率超声1分钟，超声2秒，停顿3秒）或用玻璃匀浆

器冰浴匀浆5-10次或使用注射器用27G针头处理裂解物10-15次（货号：PE2719，蛋白提取针头套装）,以彻底裂解细胞，收集裂解混合物，冰浴处理15分钟。

 注：此步骤不要过度匀浆或超声处理，否则得到的组蛋白会污染较多的胞浆蛋白，可以用台盼蓝染色观察细胞裂解情况，建议70-80%细胞裂解为适宜裂解程度。加入裂解缓冲液后，细胞膜完全破裂，胞浆完全释放，但细胞核保持完整。镜检下可以看到完全染成蓝色的细胞核。

       2.3.4 16,000g 4℃离心15分钟，去掉上清，保留沉淀。

2.4 组织组蛋白提取：

       2.4.1 沉淀重悬于0.25 ml 提取缓冲液中，超声处理（推荐130W功率超声2分钟，超声2秒，停顿3秒），冰浴30分钟，间歇混匀。

注：超声处理为必须步骤，否则沉淀很难彻底溶解，大大降低组蛋白提取得率。

       2.4.2 4℃16000g 离心10分钟，收集组蛋白上清。

       2.4.3 即用型中和缓冲液配制：

            取适当体积的中和缓冲液，在使用前数分钟内加入1/100体积的PMSF（100×），1/40体积去乙酰化酶抑制剂和1/500体积 1M DTT，配成即用型中和缓冲液，随后立即放于冰上待用。

       2.4.4 组蛋白上清中加入0.3倍体积即用型中和缓冲液，混匀，即为组蛋白提取溶液。

注：组蛋白溶液电泳检测时，如果加入上样缓冲液后溶液变黄，加入1/10体积中和缓冲液将颜色调整为蓝色后再上样。

2.5 组蛋白贮存：

三 实验示例：

程序：收集2 ml 293细胞（细胞密度1×10⁷），PBS漂洗2次，加入1 ml即用型裂解缓冲液，混匀，冰浴15分钟；离心收集细胞，加入0.5 ml即用型裂解缓冲液，130W功率超声1 min，冰浴15分钟；16000 g离心15分钟；沉淀中加入0.25 ml即用型提取缓冲液，130W功率超声2分钟，冰浴15分钟；16000 g 离心15分钟；收集0.2 ml组蛋白上清，加入60 μl中和缓冲液，即为组蛋白提取溶液。取40 μl组蛋白溶液，加20 μl 5×上样缓冲液，20 μl水，10 μl中和缓冲液（溶液由黄色变为蓝色），制备为组蛋白上样溶液，上样5，10，15，20 μl。电泳后FastBlue染色30分钟。