动物膜蛋白提取试剂盒（细胞样品）

(Animal Membrane Protein Extraction Kit for Cells)

● 产品简介

动物膜蛋白提取试剂盒（细胞样品）(Animal Membrane Protein Extraction Kit for Cells)提供了一种简便的地从培养细胞或贴壁细胞中提取膜蛋白的方法。提取的膜蛋白不仅包括质膜上的膜蛋白，也包括细胞器膜如线粒体膜、内质网膜和高尔基体膜上的膜蛋白。

本产品与许多用于分离膜蛋白的程序不同，该试剂盒不需要超声，不需要耗时的超速离心，不使用去垢剂，最大限度地保持了膜蛋白在细胞内的原始状态。提取的基本原理是通过提取溶液和离心柱的协调作用提取得到高纯度的膜蛋白。膜蛋白提取溶液可以温和作用于细胞膜，改变细胞的渗透压，然后在高速离心下细胞通过离心柱，这个过程中细胞膜会破裂；收集液700 g低速离心分离去除细胞核，因此消除了膜组分中细胞核组份的污染；随后上清使用常规台式低温离心机（无需超速离心）16000 g高速离心，沉淀即为膜蛋白。

该产品约60分钟即可完成培养细胞膜蛋白的提取。膜蛋白是在温和、非变性条件下提取的，结合不同的溶解液，溶解后的膜蛋白可以用于SDS-PAGE变性电泳检测、Blue Native非变性电泳检测以及等电聚焦电泳等。另外，膜蛋白也可以用于酶活性测定，免疫沉淀，ELISA测定等。

对于细胞样品，如果每次使用细胞的数量为2-5×10⁶，本试剂盒可以提取125个样品；如果每次使用的细胞数量为1×10⁷细胞，本试剂盒可以提取50个样品。

● 产品组成

● 贮存、效期和运输：

根据标签温度贮存；一年有效；试剂盒常温运输。

● 用前必读：

1. 离心机请调整成RCF/g模式，按照离心力设置离心机（不要根据转速rpm模式设置），所有离心步骤都需要在4℃低温离心机中进行。

2. 将膜蛋白提取溶液混匀后放置于冰上。将离心柱套入2 ml连盖收集管中，盖好管盖，放置于冰上预冷。

3. 蛋白提取推荐添加蛋白酶抑制剂（自备，试剂盒不提供），根据蛋白酶抑制剂母液浓度提前添加在膜蛋白提取溶液中（如抑制剂母液是 100×，添加时按照1:100添加，即1ml膜蛋白提取溶液添加10μl抑制剂）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制剂（自备，试剂盒不提供）。

4. 蛋白定量推荐使用BCA方法，可以选择BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7102）。

● 使用方法：

一 培养细胞膜蛋白提取：

1.1 准备溶液：

混匀膜蛋白提取溶液，立即放置在冰上。取适当量的溶液，在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂（自备，试剂盒不提供），随后立即放于冰上待用。按照下表大体估算膜蛋白提取溶液使用体积：

注： (二百万，2×10⁶)HeLa细胞，其细胞沉淀体积（PCM，Packed Cell Volume）大约为20 μl。

1.2 准备细胞：

1.2.1 对于贴壁细胞：细胞用PBS漂洗一遍，弃PBS；再加入适量PBS，用细胞刮刀刮下细胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。400 g（~2000 rpm） 4℃离心5 min收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白。

1.2.2 对于悬浮细胞：400 g（~2000 rpm）4℃离心5 min收集细胞，用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

1.3 裂解细胞膜：

1.3.1细胞沉淀中加入准备好的膜蛋白提取溶液（含蛋白酶抑制剂），用移液器吹打重悬细胞沉淀，涡旋剧烈震荡30-60秒，冰浴处理10分钟，间歇2-3混匀。

注：提取溶液使用推荐经验值：起始细胞数低于5×10⁶加入 200 μl 提取溶液，起始细胞数量5×10⁶-1×10⁷加入500 μl提取溶液。如果细胞数目低于1×10⁶或高于1×10⁷，建议调整细胞数目在2-5×10⁶范围内。

1.3.2 将细胞悬液转移到离心柱中，盖上管盖，16,000 g（~13000 rpm） 4℃离心1分钟，离心后收集管底部会有沉淀形成。

     注：离心柱最大体积为600 μl；确保离心机可以在10秒内达到16000 g。

   1.3.3 弃去离心柱，盖好2 ml收集管管盖，用1ml移液器轻柔吹打重悬收集管中的沉淀。

1.4 去除细胞核：

溶液700 g（~2700 rpm） 4℃离心1分钟，用200 μl吸头小心将上清（上清稍有浑浊）转移到新的1.5 ml离心管中。注意：转速不要超过700g，否则会降低膜蛋白的得率。

     关键步骤：吸取上清时不要触及沉淀，甚至可以丢弃部分上清不吸取，以免上清（含膜蛋白）中污染核蛋白。如果使用200 μl提取溶液，建议吸取150 μl上清；使用500 μl提取溶液，建议吸取400 μl上清。此步骤得到的细胞核纯度不高，混杂有没有完全破碎的完整细胞，不建议用于相关实验。

1.5 沉淀膜蛋白：

上清溶液16000 g（~13000 rpm） 4℃离心30分钟，用200 μl吸头吸弃上清，沉淀即为提取的膜蛋白。上清是胞浆蛋白，如需要可保存备用。

关键步骤：此步骤必须完全将上清吸取干净，可以分次吸取上清，最后用10 μl吸头将残余上清彻底吸净，以免膜蛋白中污染胞浆蛋白。

 二 膜蛋白溶解：

膜蛋白沉淀可以根据下游实验需求用50 μl相应溶解液溶解。

注：不建议加入超过50 μl溶解液，会导致蛋白浓度偏低。

2.1 膜蛋白变性样品处理：

2.1.1 建议使用50 μl变性蛋白溶解液（货号：PS1020）溶解膜蛋白；

2.1.2 BCA方法测定蛋白浓度；

2.1.3用变性蛋白溶解液调整蛋白浓度为1 μg/μl，按需分装，每管50 μl，-80℃保存待用；

2.1.4取一管50 μl样品加入SDS-PAGE上样缓冲液（货号：PL080，PL113，PL121）处理，建议调整上样液浓度为0.5 μg/μl；对于多次跨膜蛋白（Multi-pass membrane protein）的变性电泳检测，样品建议使用37℃处理30分钟或者70度处理10分钟，不要95℃加热5分钟，因为在95℃高温情况下，多次跨膜蛋白极易聚集形成多聚体，样品会聚集，WB检测会表现为比实际蛋白大小更大的分子量；

2.1.5 使用SDS-PAGE凝胶（货号：RTD6132，RTD6116）电泳，每个泳道上样10-40 μl（5-20 μg）。

2.2 膜蛋白BN非变性样品处理：

2.2.1 建议使用50 μl膜蛋白重悬液（BN电泳用）（货号：PN1020）重悬膜蛋白沉淀；

2.2.2 BCA方法测定蛋白浓度（货号：RTP7102）；

2.2.3 用膜蛋白重悬液（BN电泳用）调整蛋白浓度为1 μg/μl，按需分装，每管50 μl，-80℃保存待用；

2.2.4 取一管50 μl样品，溶化混匀后4℃ 16000 g 5分钟，去除上清，保留沉淀；

2.2.5 沉淀中加入50 μl膜蛋白增溶液A（货号：DM1080），轻柔重悬沉淀，尽量不产生气泡，冰浴10分钟；

膜蛋白增溶液A配制方法：在增溶剂粉末管中加入2.5 ml溶解缓冲液，加入超纯水精准定容至5 ml，彻底混匀，增溶液中DDM终浓度为1%。

2.2.6 4℃ 16000 g 15分钟，取上清至一干净1.5 ml离心管中即为增溶后膜蛋白溶液（小心不要吸取沉淀），此时得到的膜蛋白浓度为1 μg/μl，其中去垢剂DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）终浓度为1%；

2.2.7 膜蛋白溶液中加入1/10体积10×膜蛋白A型上样缓冲液（配套膜蛋白增溶液A使用）（货号：PL130），使用BN凝胶电泳（货号：RTD6139，RTD6140），每个泳道上样5-20 μg。

2.3 膜蛋白等电聚焦样品处理（2D凝胶第一维电泳）：

建议膜蛋白沉淀中使用溶解液：7 M尿素,2 M硫脲, 2%CHAPS,20mM DTT(自备，试剂盒不提供)。

 三 关于膜蛋白产量和质量的评价：

 3.1 膜蛋白产量：

3.2 膜蛋白质量评价：

膜蛋白质量评价首先看提取的蛋白是否是膜蛋白，其次要看膜蛋白是否有明显的富集，其三要看提出的膜蛋白是否有其他组分交叉污染，最后看提取的膜蛋白中是否可以检测出目的蛋白。使用专门的膜内参检测（下表），可以初步确认提出的是膜蛋白。膜蛋白是否有效富集需要用总蛋白作为对照，与总蛋白相比，膜蛋白中膜蛋白内参是否有明显富集。膜蛋白中的交叉污染可以用其他组分内参检测膜蛋白样品，如关注膜蛋白中是否有细胞核蛋白污染，可以使用核蛋白内参如Lamin B1检测膜蛋白，检测无条带即说明膜蛋白与细胞核组分无交叉污染。用目标蛋白抗体检测膜蛋白，验证是否可以检测到目的蛋白，蛋白大小是否符合预期。

许多研究人员利用 WB对分离的膜蛋白进行纯度检测，经常发现一些常用的胞浆内参能在膜蛋白中检测到，例如β-actin^[1], GAPDH ^[2] 和  β-tubulin ^[3]，这是由于这些胞浆内参不仅存在于胞浆也存在于质膜中，因此可以在膜蛋白中检测到胞浆内参。更多信息，请参阅以下论文：

1. Gruenstein E., et al. (1975). Actin associated with membranes from 3T3 mouse fibroblast and Hela cells. Journal of cell Biology. 64:223-234.  

2. Terrasse R., et al. (2012). Human and pneumococcal cell surface glyceraldehydes  -3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) proteins are both ligands of human C1q protein. J. Biol. Chem. 287:42620-42633.

3. Wolff J. (2009). Plasma membrane tubulin. Biochemica et BiophysicaActa. (BBA)-Biomembranes 1788:1415-1433.

四 实验示例：

样品：K562细胞，膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白（M）和胞浆蛋白（C），RIPA提取总蛋白（TP）

温度处理：样品与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（货号：PL080）混合，37度处理30min，70度处理10min，95度处理5min

电泳：4-18% RealPAGE预制胶（货号：RTD6119-0420），蛋白上样量均为5 μg，恒压200V  55min

转膜：0.45μm PVDF膜，1×RealBlot转膜缓冲液（货号：RT5020）湿转，恒流400 mA 35min。

封闭：快速封闭液（货号：WR5020）  RT  10 min

剥离：Western一抗二抗去除液（弱碱，温和型） （货号：WS1200），37度摇床15 min

一抗：1 Na-K ATPase  1:5000；2 Calnexin 1:500；3 β-Tubulin 1:5000 ；4 β-Actin 1:10000；5 GAPDH 1:10000； 6 H3 1:10000；7 COXIV 1:5000；常温摇床孵育60min

二抗：羊抗兔IgG-HRP 1:5000（货号：HGR1020），羊抗鼠IgG-HRP 1:5000（货号：HGM1060），常温摇床孵育60min

检测：ECL发光检测（货号：EC2520）