动物线粒体提取试剂盒（细胞样品）

          (Animal Cell Mitochondria Isolation Kit)     

● 产品简介

动物细胞线粒体提取试剂盒(Animal Cell Mitochondria Isolation Kit)可以快速便捷分离培养细胞的线粒体。试剂盒的缓冲系统不含任何表面活性剂和螯合剂EDTA，分离获得的线粒体纯度较高，并且绝大部分分离获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，可以用于线粒体的生理功能等方面的研究。另外，优化的裂解配方配套离心柱法有效裂解细胞，省去了经典方法使用玻璃匀浆器的繁琐操作，更加省时省力。同时，本试剂盒在分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞胞浆蛋白，可以研究线粒体蛋白向胞浆内的运输机制。

该产品约30分钟即可完成培养细胞线粒体的提取。线粒体是在温和、非变性条件下提取的，结合不同的溶解液，溶解后的线粒体可以用于SDS-PAGE变性电泳检测、Blue Native非变性电泳检测以及等电聚焦电泳等。另外，提取的线粒体具有生理功能，可以用于线粒体的生理功能等方面的研究。

按照每次提取2×10⁷细胞计算，试剂盒可以使用大约50次。

● 产品组成

● 贮存条件和运输：

按照标签温度贮存；有效期一年；湿冰运输。

● 用前必读：

1. 离心机请调整成RCF/g模式，按照离心力设置离心机（不要根据转速rpm模式设置），所有离心步骤都需要在4℃低温离心机中进行。

2. 将分离缓冲液A，分离缓冲液B，漂洗缓冲液和贮存缓冲液混匀后放置于冰上。将离心柱套入2 ml连盖收集管中，盖好管盖，放置于冰上预冷。

3. 蛋白提取推荐添加蛋白酶抑制剂（自备，试剂盒不提供），根据蛋白酶抑制剂母液浓度提前添加在膜蛋白提取溶液中（如抑制剂母液是 100×，添加时按照1:100添加，即1ml膜蛋白提取溶液添加10μl抑制剂）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制剂（自备，试剂盒不提供）。

4. 蛋白定量推荐使用BCA方法，可以选择BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7102）。

● 使用方法：

一. 准备溶液：

常温溶解试剂盒中的各种溶液，溶解后立即置于冰上并混匀。如果最终实验目的是制备线粒体蛋白样品，根据样品数量，取适量体积分离缓冲液A加入蛋白酶抑制剂。按照下表大体估算分离缓冲液A的使用体积：

注:(二百万，2×10⁶)HeLa细胞，其细胞沉淀体积（PCV，Packed Cell Volume）大约为20 μl。

二. 收集细胞：

2.1 对于贴壁细胞：细胞用PBS漂洗一遍，弃PBS；再加入适量PBS，用细胞刮刀刮下细胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。400 g（~2000 rpm） 4℃离心5 min收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白。

2.2 对于悬浮细胞：400 g（~2000 rpm）4℃离心5 min收集细胞，用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

三. 裂解细胞膜：

3.1细胞沉淀中加入250 μl准备好的分离缓冲液A（含蛋白酶抑制剂），用移液器吹打重悬细胞沉淀，涡旋剧烈震荡30-60秒，冰浴处理10分钟，间歇2-3混匀。

注：建议将起始细胞数不要低于2×10⁷，否则将导致最后线粒体得率过低。

3.2 将细胞悬液转移到离心柱中，盖上管盖，16,000 g（~13000 rpm） 4℃离心1分钟，离心后收集管底部会有沉淀形成。

     注：离心柱最大体积为600 μl；确保离心机可以在10秒内达到16000 g。

3.3 弃去离心柱，盖好2 ml收集管管盖，用1ml移液器轻柔吹打重悬收集管中的沉淀。

四. 去除细胞核和未破碎的细胞：

溶液700 g（~2700 rpm） 4℃离心1分钟，用200 μl吸头小心将上清（上清稍有浑浊）转移到新的1.5 ml离心管中。注意：转速不要超过700g，否则会降低线粒体的得率。

关键步骤：吸取上清时不要触及沉淀，甚至可以丢弃部分上清不吸取，以免上清（含线粒体）中污染核蛋白。如果使用250 μl分离缓冲液A，建议吸取200 μl上清。此步骤得到的细胞核纯度不高，混杂有没有完全破碎的完整细胞，不建议用于相关实验。

五. 收集线粒体：

5.1 上清中加入等体积的分离缓冲液B（如步骤4吸取200 μl上清，则加入200 μl分离缓冲液B），混匀；

5.2 16000 g（~13000 rpm） 4℃离心10分钟，用200 μl吸头吸去上清，沉淀即为提取的线粒体。上清是胞浆蛋白，如需要可保存备用。

关键步骤：此步骤必须完全将上清吸取干净，可以用200μl吸头分次吸取上清，最后用10 μl吸头将残余上清彻底吸净，以免线粒体中污染胞浆蛋白。

六. 线粒体漂洗：

   线粒体沉淀中加入0.5 ml 漂洗缓冲液，轻柔重悬沉淀，16,000 g，4℃离心5分钟，弃上清，沉淀即为漂洗后的线粒体。

七. 线粒体的使用：

7.1 线粒体功能研究：

如果用于完整线粒体的功能或酶活性研究，初始2×10⁷细胞分离得到的线粒体样品中加入100-150 μl线粒体贮存缓冲液，重悬线粒体后-80℃备用。不建议长期贮存，尽快使用。

7.2 线粒体蛋白电泳：

7.2.1线粒体蛋白变性样品处理：

7.2.1.1 初始2×10⁷细胞分离得到的线粒体沉淀中建议使用50 μl变性蛋白溶解液（货号：PS1020）溶解线粒体沉淀；

7.2.1.2 BCA方法测定蛋白浓度（货号：RTP7102）；

7.2.1.3用变性蛋白溶解液调整蛋白浓度为1 μg/μl，按需分装，每管50 μl，-80℃保存待用；

7.2.1.4取一管50 μl样品加入SDS-PAGE上样缓冲液（货号：PL080，PL113，PL121）处理，建议调整上样液浓度为0.5 μg/μl；对于多次跨膜蛋白（Multi-pass membrane protein）的变性电泳检测，样品建议使用37℃处理30分钟，不要95℃加热5分钟，因为在95℃高温情况下，多次跨膜蛋白极易聚集形成多聚体，样品会聚集，WB检测会表现为比实际蛋白大小更大的分子量；

7.2.1.5 使用SDS-PAGE凝胶（货号：RTD6132，RTD6116）电泳，每个泳道上样10-40 μl（5-20 μg）。

7.2.2 线粒体蛋白BN非变性样品处理：

7.2.2.1 初始2×10⁷细胞分离得到的线粒体沉淀中建议使用50 μl膜蛋白重悬液（BN电泳用）（货号:PN1020）重悬线粒体沉淀；

7.2.2.2 BCA方法测定蛋白浓度（货号：RTP7102）；

7.2.2.3 用膜蛋白重悬液（BN电泳用）（货号：PN1020）调整蛋白浓度为1 μg/μl，按需分装，每管50 μl，-80℃保存待用；

7.2.2.4 取一管50 μl样品，溶化混匀后4℃ 16000 g 5分钟，去除上清，保留沉淀；

7.2.2.5 沉淀中加入50 μl膜蛋白增溶液A（货号：DM1080），轻柔重悬沉淀，尽量不产生气泡，冰浴10分钟；

7.2.2.6 4℃ 16000 g 15分钟，取上清至一干净1.5 ml离心管中即为增溶后线粒体蛋白溶液（小心不要吸取沉淀），此时得到的线粒体蛋白浓度为1 μg/μl，其中去垢剂DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）终浓度为1%；

7.2.2.7 线粒体蛋白溶液中加入1/10体积10×膜蛋白A型上样缓冲液（配套膜蛋白增溶液A使用）（货号：PL130），使用BN凝胶电泳（货号：RTD6139，RTD6140），每个泳道上样5-20 μg。

7.2.3 线粒体蛋白等电聚焦样品处理（2D凝胶第一维电泳）：

建议线粒体沉淀中使用溶解液：7 M尿素,2 M硫脲, 2%CHAPS,20 mM DTT(自备，试剂盒不提供)。

八 线粒体产量和质量的评价：

8.1 线粒体产量：

8.2 线粒体质量评价：

线粒体质量评价首先看提取的线粒体是否具有完整的内外膜结构（进行线粒体功能活性研究），其次要看裂解后的线粒体蛋白是否有明显的富集，其三要看裂解后的线粒体蛋白是否有其他组分交叉污染，最后看提取的线粒体中是否可以检测出目的蛋白。使用专门的线粒体内参检测（下表），可以初步确认提出的是线粒体蛋白。线粒体蛋白是否有效富集需要用总蛋白作为对照，与总蛋白相比，线粒体内参蛋白是否有明显富集。线粒体蛋白中的交叉污染可以用其他组分内参检测线粒体蛋白样品，如关注线粒体蛋白中是否有胞浆蛋白污染，可以使用胞浆蛋白内参检测线粒体蛋白，检测条带的强弱即说明线粒体蛋白与胞浆蛋白交叉污染的程度。用目标蛋白抗体检测线粒体蛋白，验证是否可以检测到目的蛋白，蛋白大小是否符合预期。

许多研究人员利用 WB对分离的线粒体蛋白进行纯度检测，经常发现一些常用的胞浆内参能在线粒体蛋白中检测到，例如β-actin^[1], GAPDH ^[2] 和 β-tubulin，这是由于这些胞浆内参不仅存在于胞浆也存在于线粒体中，因此可以在线粒体蛋白中检测到胞浆内参。更多信息，请参阅以下论文：

1 Hatch, Anna L., Pinar S. Gurel, and Henry N. Higgs. Novel roles for actin in mitochondrial fission. Journal of Cell Science (2014) 127, 1–12

2 Zhang, Jin-Ying, et al. Critical protein GAPDH and its regulatory mechanisms in cancer cells. Cancer Biol Med 2015;12:10-22.

九 实验示例：

不同去垢剂处理K562细胞线粒体3-12%BN电泳