免疫沉淀试剂盒（离心柱法）

 ● 产品简介：

免疫沉淀（Immunoprecipitation）是一种分子生物学技术，用于通过特定抗体捕获目标抗原（蛋白质）。该产品使用小于10 μg的抗体即可高效地实现抗原免疫沉淀。首先将特异性抗体加入样品中形成免疫复合物，然后将免疫复合物加到Protein A/G 琼脂糖树脂中形成Protein A/G-抗体-抗原复合物，洗涤该复合物以除去未结合的物质，再以变性洗脱缓冲液或低pH的酸性洗脱缓冲液将结合的免疫复合物从Protein A/G上洗脱。

该试剂盒包含确保抗原高产量的优化缓冲液和高效离心柱和收集管，通过减少处理和混合时间简化实验步骤，能有效避免普通离心方法不易吸取上清的问题。 离心柱经过优化处理，可以使用少至20 μl的Protein A/G树脂。

特别提示：试剂盒配套的IP裂解缓冲液含有温和的去垢剂Triton X-100，可以有效提取胞浆蛋白和核蛋白。然而对于部分核蛋白（如与染色体紧密结合的核蛋白）以及膜蛋白（特别是多次跨膜蛋白）提取效果不好，不建议使用该试剂盒进行免疫沉淀。

以每次使用20 μl Protein A/G 琼脂糖树脂计算，试剂盒可以进行20次IP反应。

● 产品组成：

● 产品贮存、运输及效期：

按照标签温度贮存；常温运输；有效期一年。

● 用前必读：

1. 除非另有说明，所有操作在 4℃下进行。

2. 树脂的所有离心步骤需在低速（如 1000×g）、1 min条件下操作。离心速度大于 5000× g 可能会导致树脂聚集，难以重悬。

3. 离心柱离心过程中，使用2 ml离心管收集时流穿的液体体积应不超过 600 μl，使用1.5 ml离心管

收集时则应不超过 300 μl。体积超出可能导致柱内产生回压及洗涤和洗脱不完全。

4. 使用此试剂盒时抗体将与免疫沉淀的抗原一起被洗脱。因此，在还原型 SDS-PAGE 凝胶或 Western blot时至少产生三个蛋白条带：抗体重链（ ~50 kD） 、轻链（~25 kD ）和抗原。如果抗体条带掩盖了免疫沉淀的抗原，则可用重链或轻链专一性IgG-HRP检测目的蛋白，避免轻重链的干扰。

5. 为了优化结果，尽量使用亲和纯化后的抗体。尽管也可使用血清，但血清样品中针对目的抗原的特异性抗体含量可能仅占IgG 总量的 1-2%，因此，将导致抗原产量低。

6.  IP 裂解缓冲液已进行过代表性细胞类型的检测，包括但不限于下列细胞系：  HeLa， Jjurkat，K562，A431，A549，MOPC，NIH  3T3 和 U2OS。通常情况下，10⁶的 HeLa 细胞可以产生约10 mg的细胞团块，按照~3 μg/μl的配比使用 IP裂解缓冲液（即 100 μl IP裂解缓冲液可以裂解~300 μg细胞团块 ）。  

7. 为了获得最佳结果，可添加蛋白酶抑制剂或/和磷酸酶抑制剂，以尽量减少细胞裂解液中蛋白质的降解和去磷酸化。

8. IP裂解缓冲液可兼容BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7102）。

9. 在免疫沉淀时，建议按照步骤2.2使用与捕获抗体种属相同的正常IgG配制相同稀释比的工作液作为阴性对照。本试剂盒中未提供IgG，客户请自备。

● 操作步骤：

一. 哺乳动物细胞裂解 ：

1.1 裂解贴壁细胞 ：

1.1.1 小心去除细胞中的培养基。

1.1.2 用 PBS清洗细胞一次。

1.1.3 将冰上预冷的 IP裂解缓冲液加入细胞中（表1）；冰上孵育 5 分钟并间歇混匀；用细胞刮刀刮下细胞或用移液器吹打下细胞。

表 1 不同标准的细胞培养皿/板中 IP裂解缓冲液的建议添加量

1.1.4 将细胞裂解液转移到微量离心管中，冰浴10-30分钟，间歇混匀；13000 ×g离心10分钟以沉淀细胞碎片。

1.1.5 将上清转移到一个新的微量离心管中用于进行蛋白浓度测定和后续分析。

1.2 裂解悬浮细胞：

1.2.1将细胞悬浮液在 450 ×g下离心 5分钟以沉淀细胞；弃掉上清。

1.2.2将细胞团块用 PBS重悬洗涤一次。450× g离心 5分钟再次沉淀细胞。

1.2.3将冰上预冷的 IP裂解缓冲液加到细胞团块中。每 50 μl湿重细胞沉淀体积加入 500 μl IP裂解缓冲液。注：(五百万，5×10⁶) Jurkat细胞，其细胞沉淀体积（PCV，Packed Cell Volume）大约为50 μl。

1.2.4  将细胞裂解液在冰上孵育10-30分钟并间歇混匀。13000 ×g离心10 分钟去除细胞碎片。

1.2.5 将上清转移到一个新的微量离心管中用于进行蛋白浓度测定和后续分析。

二. 制备免疫复合物：

 注：样品用量和孵育时间取决于每个特定的抗体-抗原体系，并且可能需要优化实验方案以使产量最大化。以下方案是针对 2-10 μg 亲和纯化的抗体（Protein A/G 琼脂糖树脂使用20 μl），且可以根据需要按比例放大。

2.1 将 2-10 μg亲和纯化的抗体与步骤1.2.5得到的细胞裂解液上清在微量离心管中混合，混合体积控制在300 - 600 μl。每个IP反应总蛋白建议量是 500-1000 μg。

2.2 可选：可以使用与IP捕获抗体种属相同的正常IgG配制相同稀释比的工作液，作为阴性对照。如IP捕获抗体使用兔源抗体，阴性对照则使用兔IgG。

2.3 在 4℃旋转孵育 1小时至过夜，以形成免疫复合物。

三. 捕获免疫复合物：

3.1 轻旋 Protein A/G 琼脂糖树脂，以获得均一的悬浮液。使用大口径或截短枪头取20 μl树脂浆液加入离心柱中。将离心柱放于收集管中，1000×g 离心1分钟，弃掉流穿液体。

3.2 用200 μl预冷的洗涤缓冲液洗涤树脂两次；每次洗涤后弃掉流穿液体。

3.3 将步骤2.3的免疫复合物样品加入含有Protein A/G 琼脂糖树脂的离心柱中，盖上管盖温和地上下翻转常温孵育 1 小时。

3.4 将离心柱置于一干净的2 ml离心管中（自备）。1000×g 离心1分钟并保留流穿液体。

注：在确定 IP反应成功之前不要丢弃该液体。

3.5 将离心柱置于一个新的1.5 ml离心管中(自备)，加入200 μl 洗涤缓冲液，1000×g 离心 1 分钟，弃流穿液。

3.6 重复步骤3.5二次。

四. 洗脱免疫复合物：

注：有两种方案可以洗脱免疫复合物。变性缓冲液洗脱适用于 Western blot 分析；酸性洗脱液适用于酶法或功能测定。

4.1 变性洗脱液洗脱：

4.1.1 将含有树脂的离心柱置于一个新的1.5 ml离心管中（自备），加入50 μl 变性洗脱液，在95℃下孵育10 分钟。

4.1.2 1000×g 离心1 min，收集洗脱液。

注：加热含有变性洗脱液的树脂后，该树脂将不能被重复使用且必须丢弃。

4.2 酸性洗脱液洗脱：

4.2.1 将离心柱置于一个新的1.5 ml离心管中（自备），加入 50 μl酸性洗脱液。在常温下孵育 10分钟。1000×g 离心1min，收集洗脱液。

4.2.2 为了中和低pH 值的酸性洗脱缓冲液（例如为了进行下游的酶法或功能测定），洗脱后立即向洗脱液中加入1/10体积中和缓冲液，如50 μl洗脱液加入5 μl中和缓冲液，混匀。

● 实验示例：

1 制备免疫复合物：

GAPDH-IP：5 μl GAPDH兔单抗加400μl（640 μg）K562总蛋白（1.6 μg/μl），4度 混匀1h

IgG-IP：1 μl兔IgG加400 μl（640 μg）K562总蛋白（1.6 μg/μl），4度 混匀1h

2 捕获免疫复合物：

取20 μl Protein A/G加入离心柱中，1000g min；100 μl IP裂解液洗涤两次；

将免疫复合物上柱，RT 混匀1h，形成Protein A/G-Ab-An复合物；200 μl 1×TBS洗涤柱3次

3 洗脱免疫复合物-变性洗脱：

用干净的1.5ml 离心管做收集管，柱子中加入50 μl 变性洗脱液，95度 10 min；1000g 1min，收集管内为待测样品；IgG-IP 上样10 μl，GAPDH-IP 上样5，10，15 μl。

Input为IP裂解液提取K562总蛋白，5×BME配制成1μg/μl上样液，上样10 μl（10 μg）

4 电泳：4-20% 梯度胶 200V 50min

5 转膜：Turbo快速半干转，滤布，0.22 NC膜，恒流1.3A 10min。

6 快封：快速封闭液（WR5020 ）RT封闭10min

7 检测：兔GAPDH单抗1：5000 RT 1h，羊抗兔IgG-HRP 1：5000 RT 1h，ECL 1秒