RNA尿素电泳推荐电泳Marker：单链RNA Marke（货号：RTM505）
RNA尿素PAGE电泳试剂盒（货号RTE4103）
RNA Urea PAGE Electrophoresis Kit
● 产品组成：
|
序号
|
货号
|
名称
|
规格
|
保存条件
|
|
1
|
RTE4103-01
|
40%PAA(29:1) （RNase-free）
|
100 ml
|
4℃
|
|
2
|
RTE4103-02
|
10×TBE（RNase-free）
|
500 ml
|
RT
|
|
3
|
RTE4103-03
|
尿素（电泳级）
|
220 g
|
RT
|
|
4
|
RTE4103-04
|
RNase-free水
|
100 ml
|
4℃
|
|
5
|
RTE4103-05
|
2×RNA上样缓冲液
(尿素变性胶，RNase-free)
|
1 ml
|
-20℃
|
|
6
|
RTE4103-06
|
RNA核酸染料
|
0.5 ml
|
4℃
|
|
7
|
AP020P
|
APS（干粉）
|
5 ml
|
RT (配制后-20℃贮存)
|
|
8
|
TA0761
|
TEMED
|
0.5 ml
|
4℃，避光
|
|
9
|
|
说明书
|
一份
|
|
● 产品简介：
核酸尿素 PAGE 电泳是研究寡核苷酸和RNA电泳的重要研究手段。可以检测2-500碱基的寡核苷酸或RNA片段，理论上可以分辨出相差一个核苷酸的片段。
本公司提供的RNA尿素PAGE电泳试剂盒包含凝胶制备及电泳所需的全部试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水，即可配制各种浓度的PAGE胶，使用方便。
按照每次制备7 ml 8%凝胶（大小10×8cm，1mm厚度）计算，试剂盒可使用至少60次。
● 贮存和运输：
试剂盒按照标签温度贮存，有效期一年。试剂盒常温运输。
● 使用说明：
一、制备凝胶：
10% APS配制-5 ml：
将0.5 gAPS干粉溶于5 ml RNase-free水中，彻底溶解后分装，1 ml/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10% APS。
1.1．参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
1.2．分离胶配制：根据表格一，将不同体积的成分混合，漩涡搅拌至尿素彻底溶解。
表一 TBE-尿素PAGE分离胶配方表 (总体积5 ml，适用于厚度1.0 mm小板胶)
|
RNA长度
|
最佳凝胶浓度
|
尿素(克)
|
40%PAA
（29:1）
|
10×TBE
|
RNase-free水
|
10%APS
|
TEMED
|
|
200-1000 nt
|
5%
|
2.1克
|
0.625 ml
|
0.5 ml
|
至体积5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
50-400 nt
|
8%
|
2.1克
|
1 ml
|
0.5 ml
|
至体积5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
30-300 nt
|
10%
|
2.1克
|
1.25 ml
|
0.5 ml
|
至体积5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
40-200 nt
|
12%
|
2.1克
|
1.5 ml
|
0.5 ml
|
至体积5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
10-150 nt
|
15%
|
2.1克
|
1.875 ml
|
0.5 ml
|
至体积5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
|
6-100 nt
|
20%
|
2.1克
|
2.5 ml
|
0.5 ml
|
至体积5 ml
|
50 μl
|
5 μl
|
1.3在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5 cm的水层，使凝胶表面保持平整。
1.4静置10-20分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
1.5去除覆盖在分离胶上的水层；按照表二将不同体积成分在一个小烧杯中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
表二 TBE-尿素PAGE 4%浓缩配方表 (总体积2 ml，适用于1.0mm厚度胶)
|
各组份体积（ml）
|
|
尿素
|
40%PAA（29:1）
|
10×TBE
|
RNase-free水
|
10%APS
|
TEMED
|
|
0.84克
|
0.2 ml
|
0.2 ml
|
补至体积2 ml
|
20 μl
|
2 μl
|
1.6将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
1.7常温静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
二、电泳：
2.1. 预电泳：拔出梳子，用1×TBE缓冲液彻底冲洗加样孔2-3次，去除残余的尿素。电泳槽内外加入适量1×TBE缓冲液稳压200 V预电泳30分钟。
注：试剂盒配套的10×TBE缓冲液和RNase-free水仅够配制凝胶用，1×TBE电泳缓冲液原料和RNase-free水请自己准备，配方如下：
|
终浓度
|
顺序
|
原料
|
1升
|
5 升
|
|
89 mM
|
1
|
Tris碱 [MW121.14]
|
10.8 克
|
54克
|
|
2 mM
|
2
|
EDTA 2Na·2H2O [MW372.24]
|
0.744 克
|
3.72克
|
|
89 MM
|
3
|
硼酸 [MW61.83]
|
5.5 克
|
27.5克
|
|
|
4
|
RNase-free水最后定容至
|
1 升
|
5 升
|
|
|
|
最后pH在8.2-8.3之间，可以不用调节pH，记录每批pH
|
2.2. 取 3-5 μl样品，加入等体积2×RNA上样缓冲液，70℃处理5分钟后立即冰浴，上样。
2.3. 连接电源线，打开电源开关，按照以下条件电泳。
|
|
恒电压
|
起始电流
|
结束电流
|
电泳时间
|
适用条件
|
|
推荐电压
|
200V
|
15-20 mA/板胶
|
8-15 mA/板胶
|
50+ min
|
最佳电压，最优的分辨率
|
2.4. 根据下表溴酚蓝指示前沿位置判断条带位置，取出凝胶进行后续实验。
|
变性胶浓度
|
溴酚蓝
|
二甲苯菁
|
|
5%
|
35 nt
|
130 nt
|
|
8%
|
19 nt
|
75 nt
|
|
10%
|
15 nt
|
55 nt
|
|
12%
|
12 nt
|
55 nt
|
|
15%
|
10 nt
|
52 nt
|
|
20%
|
5 nt
|
50 nt
|
三、染色：
3.1染色液配制：取一合适的容器，加入100 ml 1×TBE，随后加入10 μl RNA核酸染料混匀。
3.2 染色：取下凝胶放入染色液中，常温下摇床轻轻地摇动凝胶染色，最佳的染胶时间为15-20 分钟，这取决于凝胶的厚度、聚丙烯酰胺的浓度和 RNA 的长短。凝胶越厚或聚丙烯酰胺的浓度越高，染色所需要的时间就越长。注：染色溶液至少可重复使用2-3次。如果不立即再用的话，建议将用过的染色溶液冷藏避光保存。
3.3 观察：紫外灯下观察条带。
