EMSA PAGE凝胶配制试剂盒
PAGE
Electrophoresis Kit for EMSA
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货号
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名称
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规格
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RTE4104
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EMSA PAGE凝胶配制试剂盒
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30-60次
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● 产品组成：
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货号
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名称
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规格
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贮存
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RTE4104-01
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40%PAA(37.5:1)
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50 ml
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4℃，避光
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RTE4104-02
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5×TBE
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50 ml
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RT
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RTE4104-03
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80%甘油
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20 ml
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RT
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AP020P
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APS（干粉）
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5 ml
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RT（配制后-20℃贮存）
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TA0761-01
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光
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● 产品简介：
EMSA PAGE凝胶配制试剂盒(PAGE Gel Preparation Kit for PAGE)提供了配制EMSA PAGE凝胶所需的各种试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水，即可配制不同浓度的EMSA PAGE凝胶。凝胶迁移实验(也称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验)
(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)，也称Gel Shift，是一种用于研究蛋白与核酸相互作用的高灵敏实验技术。主要用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用于蛋白与DNA、蛋白与RNA相互作用研究。EMSA技术基于进行非变性聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳时，蛋白质与DNA或RNA复合物的迁移速度比游离线性DNA或RNA片段慢，从而导致DNA或RNA迁移位置在与蛋白质结合时滞后。
本试剂盒大约可以配制30-50块常规大小（8×10 cm）PAGE凝胶，具体数量根据凝胶厚度决定：0.75mm厚度凝胶可以配制60块胶，1 mm厚度凝胶可以配制45块胶，1.5 mm厚度凝胶可以配制30块胶。
● 贮存和效期：
本产品常温运输；按照标签温度贮存；有效期一年。
● 使用说明：
10% APS配制-5 ml：
将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中，彻底溶解后分装，1 ml/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少常温存放时间，以防失效，若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10% APS。
一、制备凝胶步骤：
1.1 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
1.2按照表格将不同体积的成分在小烧杯中混合；最后加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。配制一块常用EMSA PAGE胶(8×10 cm)所需凝胶溶液体积：0.75 mm厚度凝胶约5 ml；1 mm厚度凝胶约7 ml；1.5 mm厚度凝胶约10 ml。均含约0.5 ml的余量。
EMSA PAGE凝胶配方表一 (0.75 m厚度凝胶)：
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总体积5 ml，适用于厚度0.75 mm小板胶
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各组份体积（ml）
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胶浓度
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灭菌水
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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3.8
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0.5
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0.156
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0.5
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0.05
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0.005
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5%
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3.66
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0.625
|
0.156
|
0.5
|
0.05
|
0.005
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6%
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3.54
|
0.75
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0.156
|
0.5
|
0.05
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0.005
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EMSA PAGE凝胶配方表二 (1.0 mm厚度凝胶)：
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总体积7 ml，适用于厚度1 mm小板胶
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各组份体积（ml）
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胶浓度
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灭菌水
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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5.3
|
0.7
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0.22
|
0.7
|
0.07
|
0.007
|
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5%
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5.2
|
0.875
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0.22
|
0.7
|
0.07
|
0.007
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6%
|
5.0
|
1.05
|
0.22
|
0.7
|
0.07
|
0.007
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EMSA PAGE凝胶配方表三 (1.5 mm厚度凝胶)：
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总体积10 ml，适用于厚度1.5 mm小板胶
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各组份体积（ml）
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胶浓度
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灭菌水
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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7.6
|
1
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0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
|
|
5%
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7.4
|
1.25
|
0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
|
|
6%
|
7.1
|
1.5
|
0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
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1.3在玻璃板中灌入凝胶溶液至玻璃板顶端，插入梳子，避免产生气泡。
1.4静置20-60分钟，等待凝胶完全聚合。
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环境温度
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凝固时间
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低于18度
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＞60分钟
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18度
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~40分钟
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25度
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~30分钟
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高于25度
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~20分钟
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注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
二、电泳：
2.1预电泳：拔出梳子，用0.5×TBE缓冲液彻底冲洗加样孔2-3次。电泳槽内外加入适量0.5×TBE缓冲液，稳压100 V预电泳10分钟。
注：试剂盒配套的5×TBE缓冲液仅够配制凝胶用，0.5×TBE电泳缓冲液请自己制备，配方如下：
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终浓度
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顺序
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原料
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1升
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5 升
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44.5 mM
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1
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Tris碱 [MW121.14]
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5.4 克
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27克
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1 mM
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2
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EDTA 2Na·2H2O [MW372.24]
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0.372 克
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1.86克
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44.5 MM
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3
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硼酸 [MW61.83]
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2.75 克
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13.75克
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4
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超纯水最后定容至
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1 升
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5 升
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最后pH在8.2-8.3之间，可以不用调节pH，记录每批pH
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2.2 把混合了无色上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10 μl稀释好的1X的EMSA 上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
2.3 稳压100 V电泳，可以冰浴或4度条件下电泳，确保胶的温度不超过30℃。电泳至上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。