单链DNA Marker（10-75 nt）非预混型                          

● 产品编号及规格：

● 产品简介：

单链DNA Marker由不同长度的单链DNA分子混合而成，9条带的大小为10，15，20，25，30，35，40， 50，75 nt。该产品不含有上样缓冲液，可以根据实验需求使用不同的上样缓冲液，用于尿素变性电泳或非变性电泳。电泳后的PAGE胶可以使用单链DNA PAGE电泳染色试剂盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE电泳染色试剂盒（Cat：RTS5102），核酸快速高灵敏度染色试剂盒（Cat：RTS5101）或核酸染料如RealSafe Red（货号：GR002）或RealSafe All（货号：GR004）进行染色，均可以得到清晰的条带分离效果。

产品附带2×TBE尿素上样缓冲液和2×非变性PAGE DNA上样缓冲液，方便待检样品的上样。

配制好的即用型单链DNA Marker以每次上样5 μl计算，该产品可以使用大约25次。

●  保存条件和运输：

按照标签温度贮存；有效期2年；湿冰运输。

● 使用方法：

一. 即用型单链DNA Marker（10-75 nt）配制方法：

1.1 进行尿素变性电泳：

1.2 进行非变性电泳：

 二. 凝胶制备：

注：以下使用方法均以8×10cm凝胶 厚1.0mm示例，其他规格凝胶请适当调整。

2.1 TBE-尿素凝胶制备：

2.1.1 可以选择DNA尿素PAGE电泳试剂盒（Cat：RTE4102））或按照以下程序制胶：

表一 TBE-尿素PAGE分离胶配方表 (总体积5 ml，适用于厚度1.0 mm小板胶)

2.1.2在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5 cm的水层，使凝胶表面保持平整。

2.1.3静置10-20分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

2.1.4去除覆盖在分离胶上的水层；按照表二将不同体积成分在一个小烧杯中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

表二 TBE-尿素PAGE 4%浓缩配方表 (总体积2 ml，适用于1.0mm厚度胶)

2.1.5将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

2.1.6静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

2.2非变性凝胶制备：

2.2.1可以选择DNA非变性PAGE电泳试剂盒（货号：RTE4101）或按照以下程序制胶。

2.2.2按照表三将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合；最后加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

2.2.3在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5 cm的水层，使凝胶表面保持平整。

2.2.4静置10-20分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合

表三 TBE-非变性PAGE分离胶配方表 (总体积5 ml，适用于厚度1.0 mm小板胶)

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

2.2.5去除覆盖在分离胶上的水层；按照表四将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

表四 TBE-非变性PAGE 4%浓缩配方表 (总体积1.5 ml，适用于1.0mm厚度胶)

2.2.6将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

2.2.7静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

三. 样品制备：

3.1 根据实验目的，配制即用型单链DNA Marker样品（步骤一）。单链DNA样品使用尿素变性电泳，双链DNA样品使用非变性电泳，单链/双链混合样品使用非变性电泳。

四. 电泳：

4.1. 预电泳（可选）：电泳槽内外加入适量1×TBE缓冲液稳压200V预电泳30分钟。电泳结束后，用1×TBE缓冲液彻底冲洗加样孔2-3次。

4.2.上样：根据梳齿确定Marker上样量， 一般是10齿1mm厚梳子上样5 μl，15齿1mm厚梳子上样3 μl。

4.3. 连接电源线，打开电源开关，按照以下条件电泳。

4.4. 等待上样缓冲液的溴酚蓝指示前沿到凝胶底部时终止电泳，取出凝胶进行后续实验。

五．染色：

用单链DNA PAGE电泳染色试剂盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE电泳染色试剂盒（Cat：RTS5102）或核酸快速高灵敏度染色试剂盒（Cat：RTS5101）染色均可以得到清晰的条带分离效果。注：如果使用核酸染料染色，RealSafe Red（货号：GR002）或RealSafe All（货号：GR004）核酸染料结合单链核酸效果最佳，强烈建议使用以便获得最佳效果的胶图。其余染料如GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。

六. 电泳示例：

6.1 使用RealSafe Red核酸染料（货号：GR002）染色：

15%尿素变性胶分离单链DNA

lane 1-9 为10，15，20，25，30，35，40，50，75 nt ssDNA 上样量为0.5 μg

lane 10：RTM501，单链DNA Marker（20-75 nt）预混型，上样量5 μl

lane 11：RTM507，单链DNA Marker（20-75 nt）非预混型，配制后上样量5 μl

lane 12：RTM509，单链DNA Marker（10-75 nt）预混型，配制后上样量5 μl

电泳条件：1×TBE，恒压200 V 50 min

染色：RealSafe Red后染20min，紫外激发

使用RTM501 单链DNA Marker（20-75 nt）发表部分文章列表：

1. [2021 IF=3.532] Real-time detection of SARS-CoV-2 in clinical samples via ultrafast ligation-dependent RNA transcription amplification

Marker :RTM501，单链DNA Marker（20-75 nt）

Author: Peng Zhang, Yang Li, Dongmei Zhang, Xinghao Zhu, Jinling Guo, Cuiping Ma and Chao Shi

Journal: Analytical Methods 2023, 15,1915

Institution： Qingdao University

Paper link：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2023/AY/D3AY00093A