RealPure Plant RNA Extraction Kit

（for containing high polysaccharide and polyphenol components）

RealPure多糖多酚植物RNA提取试剂盒

● 试剂盒内容及保存：

● 储存条件和效期：

RNase-free水4℃保存；其他试剂在常温（25℃左右）干燥条件下，可保存1年。试剂盒常温运输。

● 产品简介：

本试剂盒可从植物叶片、茎、幼苗、果肉中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。试剂盒配套缓冲液PRS（Phenolic Remove Solution）可以去除植物中的多糖多酚对RNA提取的影响。20-30分钟内即可完成反应，提取的总RNA纯度高，没有DNA和蛋白的污染，可用于Northern blot、Dot blot、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等实验。

该试剂盒不能有效提取植物种子、块茎、鳞茎的RNA，提取这些材料的RNA请选择RealPure植物种子RNA提取试剂盒（Cat：RTR2308）。

● 准备工作：

1操作前在裂解液RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如500 μl RL中加入5 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的 RL4 ℃可放置3天。

2 按照标签所示在漂洗液RW中加入无水乙醇（自备），混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。

3 所有离心步骤均在常温下进行。

● 操作步骤：

1. 样品处理:

1.1 1.5 ml离心管中加入500 μl裂解液RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），50 μl缓冲液PRS混匀备用。

注：多糖多酚植物（如银杏，毛白杨等）加入RL后，要加入缓冲液PRS，普通植物（如拟南芥，小麦，水稻，烟草）可以不加缓冲液PRS。如果不能判断植物是否为多糖多酚植物，请加入缓冲液PRS。

注：快速判断是否为多糖多酚植物：

取20mg左右的植物材料，放入1.5 ml离心管中，加入0.5 ml 0.2 M NaOH溶液，95℃ 10分钟，观察裂解物颜色。颜色为绿色或淡黄色为普通植物；颜色为棕黄色或棕红色为多糖多酚植物。

1.2将植物材料加入到液氮预冷的研钵中，用研杵研磨，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。取50 mg粉末迅速加入到离心管中，涡旋剧烈震荡混匀，常温放置5分钟。

注：一定不要加入超过50 mg的粉末，否则样品超过裂解液RL的裂解能力会导致RNA提取失败。

背景知识：样品处理量绝对不要超过RNA吸附柱处理能力，否则造成RNA残留或者产量降低。不同植物组织RNA相差极大，例如某些植物种子如绿豆RNA含量丰富，超过50 mg就会超过柱子处理能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如植物叶片或植物种子裂解溶液中都不要超过50 mg，随后根据实验结果增加或者减少处理量。

2. 离心取上清：

13,000 rpm离心5 min，小心吸取收集管中的上清至1.5 ml RNase-free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。一般可获得400 μl上清。

3. 去除基因组污染：

上清中加入0.5倍体积的无水乙醇（如400 μl上清中加入200 μl无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀一起转入DNA清除柱CS（清除柱放入收集管中）中，13,000 rpm离心2分钟，弃掉收集管中的废液。

注：确保全部溶液都收集到收集管中，如果膜上有残留液体，延长离心时间至5分钟，保证膜上无残留液体。

4. 洗脱RNA：

  将DNA清除柱放入一干净的2 ml离心管中，在清除柱中加入500 μl 裂解液RL plus，13,000 rpm离心1分钟，收集滤液（注意：RNA在滤液中，不要丢弃），滤液中加入250 μl无水乙醇，此时可能会出现沉淀，立即混匀，不要离心。

5. RNA挂柱：

  将全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm离心2分钟。

注：确保溶液全部过滤到收集管中，膜上无残留，如有必要，可以延长离心时间至5分钟。

6. 去除RNA中的蛋白污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl 去蛋白液RD，13,000 rpm离心1分钟，弃废液。

7. 去除RNA中的其他杂质：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm离心1分钟，弃废液。

8. 进一步去除RNA中的其他杂质：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），13,000 rpm离心1

分钟，弃废液，将吸附柱CR放回收集管中，确保盖好吸附柱管盖。

9.  关键步骤：彻底去除吸附柱上的残余乙醇：

13,000 rpm将吸附柱CR空甩离心2 分钟，去除吸附柱上的残余液体。

注：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。

10. 洗脱得到RNA：

将RNA吸附柱CR转入一个新的1.5 ml RNase-free离心管中，向吸附柱O型垫圈中央悬空加入50-100 μl RNase-free水（事先65℃预热可提高洗脱效率），盖好吸附柱管盖，常温放置2分钟，13,000 rpm离心2 分钟。

注：确保水要加到膜的中央,不要贴壁加入;洗脱缓冲液体积不应少于50 μl,体积过小影响回收效率。

11. RNA贮存：

RNA样品-80℃中保存。

● RNA产量和质量的评估：

1. RNA产量：

用分光光度计测定OD₂₆₀的吸光值来计算RNA产量。将RNA按照一定的比例稀释于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根据以下公式计算：

A₂₆₀×稀释倍数×40=μg RNA/ml

注：测定OD值时，尽量不要用RNase-free水稀释RNA，因为RNase-free水pH较低，测定的OD值偏低。

2. RNA质量：

凝胶电泳检测：凝胶电泳中，完整的RNA应该有两条主带：28S和18S，并且28S亮度应该与18S相当或是其亮度的2倍。可以使用普通的1×TAE琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度1-1.5 %，可以使用高电压，短时间电泳，如7V/cm电泳，20分钟。建议使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作为Marker。植物28S rRNA迁移率与1500bp类似，18S rRNA迁移率与1000bp类似。

● 问题指南:

1. 离心柱发生堵塞       

离心柱发生堵塞之后会造成 RNA 得率降低甚至不能纯化得到 RNA。

常见原因分析如下：

1.1：样本破碎不彻底。

样本破碎不彻底会使吸附柱发生堵塞，同时会影响 RNA 得率及质量。我们建议在进行样本破碎的时候，在足量的液氮中快速研磨操作，尽量破碎样本细胞壁、细胞膜等组织。

1.2 样本初始量过多。

样本使用量过多会导致裂解液RL或裂解液RSL裂解细胞时不完全，导致离心柱堵塞。RealPure多糖多酚植物RNA提取试剂盒和RealPure植物种子RNA提取试剂盒处理样本的初始最大量为50 mg。

1.3 离心机的温度过低。

整个 RNA 分离纯化除了液氮破碎样本组织外，所有的步骤均在常温（20-25℃）进行。有些低温离心机的温度低于 20℃，可能会造成离心柱的堵塞。如果发生这种现象，请将离心机温度设置到 20-25℃。

2. 提取不到RNA或者RNA产量低

通常会有多种因素影响回收效率，比如：样本 RNA 含量、操作方法、洗脱体积等。

常见原因分析：

2.1  样本保存不当或样本保存时间过久导致RNA 已经降解。

建议：新采集的样本应立即放入液氮中速冻，长期保存于-70℃并避免样本的反复冻融；或者将样本立即浸泡在 RNA 稳定剂RNAwait溶液中。

2.2  样本破碎裂解不充分导致纯化柱堵塞。

建议：在组织研磨时，请保证组织充分研磨，并在研磨完成后迅速转移至预先准备好的裂解液RL或裂解液RSL（确认已添加正确比例的 β-ME）中。

2.3  洗脱液添加不正确。

建议：确认 RNase-Free 水滴加到了纯化柱膜O型垫圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中没有添加正确体积的无水乙醇。

建议：请按照说明书，在试剂盒使用前，漂洗液RW中添加正确体积的无水乙醇并混匀。

2.5  组织样本用量不合适。

建议：每 500 μl 裂解液RL或裂解液 RSL使用最大组织量50 mg，组织使用过多会导致 RNA 提取量降低并且得到的 RNA 纯度也会降低。我们强烈建议每单次 RNA提取操作，样本初始用量一定不要超过最大建议量。

2.6  洗脱体积不合适或洗脱不彻底。

建议：纯化柱的洗脱液体积为 50-100 μl；若洗脱效果并不理想，建议在加入65℃预热的RNase-Free 水后，延长常温放置的时间，例如放置 5-10 min。

2.7  纯化柱在第二次RW洗涤之后有乙醇残留。

建议：漂洗液RW洗涤后，吸附柱空甩离心2 min是关键步骤，以充分除去吸附柱上残留的乙醇。

2.8  试剂盒使用不正确。

建议：对于多酚多糖的植物样本，务必使用缓冲液PRS，这是我们专门针对多酚多糖植物样本而研制的多糖多酚去除剂，如不添加，将导致RNA不能挂柱或提取到纯度不高的RNA。

3. 纯化获得的RNA有降解

纯化得到的 RNA 的质量和样本的保存、RNase 污染、操作等因素有关。 常见原因分析：

3.1  组织样本采集后没有及时保存。

建议：组织样本在收集后若不及时使用，请立即低温保存于液氮中或经液氮速冻后立即转移至-70℃长期保存，或者将样本立即浸泡在 RNA 稳定剂 RNAwait溶液中。提取 RNA 请尽量使用新近采取的组织样本。

3.2  组织样本反复冻融。

建议：组织样本保存时，最好剪成小段保存，使用时取出其中一部分即可，避免样本的反复冻融导致 RNA 的降解。

3.3  操作间有 RNase 引入或没有佩戴一次性手套、口罩等。

建议：RNA 提取实验最好在单独的 RNA 操作间进行，并在实验前清理好实验桌，实验时佩戴一次性手套、口罩，最大程度上避免 RNase 引入导致的RNA 降解。

3.4  试剂在使用过程中被 RNase 污染。

建议：更换新的植物总RNA 提取系列试剂盒进行相关实验。

3.5  RNA 操作时所用的离心管、枪头等有 RNase 污染。

建议：确认 RNA 提取时所用到的离心管、枪头、移液器等都是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始材料超过50 mg

建议：步骤1-样品处理时用天平称取粉末重量，不要超过50 mg，否则样品的核酸量会超过DNA清除柱CS的处理极限，导致洗脱下的RNA有基因组DNA的污染。

4.2  省略了步骤3-去除基因组污染步骤。

建议：步骤3-去除基因组污染步骤必不可少，不能省略。DNA清除柱CS能极大限度的去除上清液中的基因组 DNA，使用裂解液RL plus洗脱下的RNA基本无基因组DNA的污染。

4.3  跳过了使用去蛋白液RD的漂洗步骤（见操作步骤第6步）。

建议：这一步骤对于除去残留的 DNA 以及杂质蛋白十分重要，一定不能省略，否则将会导致纯化得到的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白污染。

5. 纯化获得的RNA影响下游实验

经吸附柱纯化的 RNA，如果盐离子、蛋白质含量过多会影响下游实验，比如：逆转录、Northern Blot 等。

1.  洗脱后的 RNA 有盐离子残留。

建议：确认漂洗液RW中添加了正确体积的乙醇，并按操作说明的离心转速进行2次RW洗涤吸附柱 （见操作步骤第7，8步）。

2.  洗脱后的 RNA 有乙醇残留。

建议：确认 RW第二次洗涤后，按操作说明的对吸附柱进行空管离心操作（见操作步骤第9 步），如果还有乙醇残留，可以将空管离心后吸附柱开盖常温放置 5 min，以最大程度上去除乙醇残留。

实验示例：