RealPure Animal Tissues/Cell RNA Extraction Kit

RealPure动物组织/细胞RNA提取试剂盒

● 试剂盒内容及保存：

● 储存条件和效期：

RNase-free水4℃贮存；其他试剂在常温（25℃左右）干燥条件下，可保存1年。试剂盒常温运输。

● 产品简介：

本试剂盒可从动物组织中快速提取总RNA， 可同时处理大量不同样品。提取的总RNA纯度高，没有蛋白和其它杂质的污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。

● 准备工作：

1操作前在裂解液RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RL中加入10 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的 RL4 ℃可放置3天。

2 按照标签所示在漂洗液RW中加入无水乙醇（自备），混匀后盖紧瓶盖后常温贮存备用。

3 所有离心步骤均在常温下进行。

● 操作步骤：

1. 样品处理和裂解:

1.1 贴壁细胞：

1.1.1直接裂解法：

不需胰酶消化，彻底吸干净培养液体后直接加推荐量裂解液 RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇）（下表）反复吹打细胞裂解，可以漩涡震荡，直到看不到细胞团为止，进行步骤2。

1.1. 2 胰蛋白酶消化法：

确定细胞数量（收集细胞数量请不要超过1×10⁷），吸除培养基，用PBS洗涤细胞，吸除PBS，向细胞中加入胰酶消化液处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至1.5 ml离心管中，300×g离心5 min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清，加 350 μl（<5x10⁶细胞）或 600 μl（5x10⁶-1x10⁷细胞）裂解液 RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），反复吹打细胞裂解，可以漩涡震荡，直到看不到细胞团为止，进行步骤2。

1.2 悬浮细胞：

300×g离心 5 min收集悬浮细胞（收集细胞数量请不要超过1×10⁷）到一个1.5ml 离心管中，完全吸弃上清，加 350 μl（<5x10⁶细胞）或 600 μl（5x10⁶-1x10⁷细胞）裂解液 RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），反复吹打细胞裂解，可以漩涡震荡，直到看不到细胞团为止，进行步骤2。

   1.3 动物组织：

       新鲜组织加入350 μl(<20mg 组织)或者 600 μl(20-30mg 组织)的裂解液RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇）后玻璃匀浆器或电动匀浆器将组织彻底研磨匀浆，进行步骤2。

注意：组织量一定不要超过30 mg，否则将导致RNA得率和质量下降。

背景知识：样品处理量绝对不要超过DNA/RNA吸附柱处理能力，否则造成DNA/RNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类DNA/RNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过5 mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过3x10⁶细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过3-4x10⁶，组织不超过10mg，随后根据实验结果增加或者减少处理量。

2. 离心得到上清：

若没有不溶性沉淀，直接进行步骤3。如有不能裂解的碎片或者不溶物，13,000 rpm离心5 min, 取裂解物上清进行下一步。

3. 去除基因组污染和洗脱RNA：

将DNA清除柱CS放入一干净的2 ml离心管内，用移液器小心将步骤1离心管内的溶液或步骤2离心后的上清全部转移到DNA清除柱CS中，13,000 rpm离心2分钟（RNA在离心管滤液中,不要丢弃）。

注：确保全部溶液都收集到2 ml离心管中，如果膜上有残留液体，延长离心时间至5分钟，保证膜上无残留液体。

4. RNA挂柱：

  向2 ml离心管滤液中加入0.5倍体积的无水乙醇（如滤液体积为300 μl/600 μl，加入150 μl/300 μl无水乙醇），此时可能会出现沉淀，立即混匀，不要离心。将全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm离心1分钟。

注：确保溶液全部过滤到收集管中，膜上无残留，如有必要，可以延长离心时间至5分钟。

5. 去除RNA中的蛋白污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl 去蛋白液RD，13,000 rpm离心1分钟，弃废液。

6. 去除RNA中的其他杂质：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm离心1分钟，弃废液。

7. 进一步去除RNA中的其他杂质：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），13,000 rpm离心1

分钟，弃废液。

8.  关键步骤：彻底去除吸附柱上的残余乙醇：

将吸附柱CR放回收集管中，确保盖好吸附柱管盖，13,000 rpm将吸附柱CR空甩离心2 分钟，去除吸附柱上的残余液体。

注：此步骤目的是将吸附柱中残余漂洗液去除，如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。

9. 洗脱得到RNA：

将RNA吸附柱CR转入一个新的1.5 ml RNase-free离心管中，向吸附柱O型垫圈中央悬空加入50-100 μl RNase-free水（事先65℃预热可提高洗脱效率），盖好吸附柱管盖，常温放置2分钟，13,000 rpm离心2 分钟。

注：确保水要加到膜的中央，不要贴壁加入；洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。

10.  RNA贮存：

RNA样品-80℃中保存。

● RNA产量和质量的评估：

1. RNA产量：

用分光光度计测定OD₂₆₀的吸光值来计算RNA产量。将RNA按照一定的比例稀释于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根据以下公式计算：

A₂₆₀×稀释倍数×40=μg RNA/ml

注：测定OD值时，尽量不要用RNase-free水稀释RNA，因为RNase-free水pH较低，测定的OD值偏低。

2. RNA质量：

凝胶电泳检测：凝胶电泳中，动物的完整RNA应该有两条主带：28S和18S，并且28S亮度应该与18S相当或是其亮度的2倍。可以使用普通的1×TAE琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度1-1.5 %，可以使用高电压，短时间电泳，如7V/cm电泳，20分钟。建

议使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作为Marker。28S rRNA迁移率与1800bp类似，18S rRNA迁移率与700bp类似。

吸光值检测：可以用A₂₃₀，A₂₆₀和A₂₈₀的数值表示RNA的纯度。纯净的RNA的 A₂₆₀/A₂₈₀比值应该为2，我们得到的RNA样品比值应在1.8-2.2之间，如果比值低于1.8，表明RNA样品中蛋白污染比较严重。A₂₆₀/A₂₃₀比值应该在2-2.2之间。如果此比值低于2，表明RNA样品中有胍盐的污染。

 ● 实验示例:

                          1.2%琼脂糖胶   1×TAE 150V 25min RealSafe Red预染

RNA提取试剂提取步骤：K562悬浮细胞，1 ml收集（6×10⁶/ml），PBS漂洗两遍，加入1 ml RNA提取试剂，悬浮后常温静置10分钟，加入氯仿或氯仿替代物200 μl，彻底混匀后静置10分钟，自然分相，4度 13000 rpm 离心15分钟，上清中加入等体积异丙醇，常温静置20分钟，4度 13000 rpm离心15分钟，沉淀用1 ml 75%乙醇漂洗，4度 8000rpm 离心2分钟，沉淀溶于50μl RNase-free水中。

RTR2306操作简述如下：K562悬浮细胞，1ml收集（6×10⁶/ml），PBS漂洗两遍（平行做2管）。沉淀中加入350 μl 裂解液RL（已加β-ME），常温裂解5分钟，裂解物加到DNA清除柱CS中，离心收集到2 ml离心管中，离心管中加入0.5倍体积无水乙醇，全部溶液加到RNA吸附柱CR中，离心，随后清除柱CS和RNA吸附柱CR一次RD漂洗，2次RW漂洗，最后每个吸附柱用50 μl RNase-free水洗脱，合并两管得到100 μl RNA和100 μl去除的基因组DNA。

● 问题指南:

1. 离心柱发生堵塞

离心柱发生堵塞之后会造成 RNA 得率降低甚至不能纯化得到 RNA。

常见原因分析如下：

1.1组织或细胞破碎不彻底。

破碎不彻底会使吸附柱发生堵塞，同时会影响 RNA 得率及质量。我们建议在进行裂解时，尽量借助辅助手段如机械匀浆彻底破碎组织。

1.2 样本初始量过多。

样本使用量过多会导致裂解液RL裂解细胞时不完全，导致离心柱堵塞。该试剂盒处理样本的初

始最大量10⁷细胞或30 mg组织。

1.3 离心机的温度过低。

整个 RNA 分离纯化所有的步骤均在常温（20-25℃）进行。有些低温离心机的温度低于 20℃，可能会造成离心柱的堵塞。如果发生这种现象，请将离心机温度设置到 20-25℃。

2. 提取不到RNA或者RNA产量低

通常会有多种因素影响回收效率，比如：样本 RNA 含量、操作方法、洗脱体积等。

常见原因分析：

2.1  样本保存不当或样本保存时间过久导致RNA 已经降解。

建议：新采集的样本应立即放入液氮中速冻，长期保存于-70℃并避免样本的反复冻融；或者将样本立即浸泡在 RNA 稳定剂RNAwait溶液中。

2.2  样本破碎裂解不充分导致纯化柱堵塞。

建议：参见1。

2.3  洗脱液添加不正确。

建议：确认 RNase-Free 水滴加到了纯化柱膜O型垫圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中没有添加正确体积的无水乙醇。

建议：请按照说明书，在试剂盒使用前，漂洗液RW中添加正确体积的无水乙醇并混匀。

2.5  组织样本用量不合适。

建议：每 600 μl 裂解液RL使用最大细胞量为1×10⁷，使用最大组织量为30 mg，过多会导致 RNA 提取量降低并且得到的 RNA 纯度也会降低。我们强烈建议每单次 RNA提取操作，样本初始用量一定不要超过最大建议量。

2.6  洗脱体积不合适或洗脱不彻底。

建议：纯化柱的洗脱液体积为 50-100 μl；若洗脱效果并不理想，建议在加入65℃预热的RNase-Free 水后，延长常温放置的时间，例如放置 5-10 min。

2.7  纯化柱在第二次RW洗涤之后有乙醇残留。

建议：漂洗液RW洗涤后，吸附柱空甩离心2 min是关键步骤，以充分除去吸附柱上残留的乙醇。

3. 纯化获得的RNA有降解

纯化得到的 RNA 的质量和样本的保存、RNase 污染、操作等因素有关。

常见原因分析：

3.1  组织样本采集后没有及时保存。

建议：组织样本在收集后若不及时使用，请立即低温保存于液氮中或经液氮速冻后立即转移至-70℃

长期保存，或者将样本立即浸泡在 RNA 稳定剂 RNAwait溶液中。提取 RNA 请尽量使用新近采取的组织样本。

3.2  组织样本反复冻融。

建议：组织样本保存时，最好分装成小份，使用时取出其中一份即可，避免样本的反复冻融导致 RNA 的降解。

3.3  操作间有 RNase 引入或没有佩戴一次性手套、口罩等。

建议：RNA 提取实验最好在单独的 RNA 操作间进行，并在实验前清理好实验桌，实验时佩戴一次性手套、口罩，最大程度上避免 RNase 引入导致的RNA 降解。

3.4  试剂在使用过程中被 RNase 污染。

建议：更换新的提取试剂盒进行相关实验。

3.5  RNA 操作时所用的离心管、枪头等有 RNase 污染。

建议：确认 RNA 提取时所用到的离心管、枪头、移液器等都是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始材料量超过最大建议量

建议：步骤1-样品处理时使用10⁷细胞或30 mg组织，不要超过最大处理量，否则样品的核酸量会超过DNA清除柱CS的处理极限，导致洗脱下的RNA有基因组DNA的污染。

4.2  省略了步骤3-去除基因组污染步骤。

建议：步骤3-去除基因组污染步骤必不可少，不能省略。DNA清除柱CS能极大限度的去除上清液中的基因组 DNA，使用裂解液RL洗脱下的RNA基本无基因组DNA的污染。

4.3  跳过了使用去蛋白液RD的漂洗步骤（见操作步骤第5步）。

建议：这一步骤对于除去残留的 DNA 以及杂质蛋白十分重要，一定不能省略，否则将会导致纯化得到的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白污染。

5. 纯化获得的RNA影响下游实验

经吸附柱纯化的 RNA，如果盐离子、蛋白质含量过多会影响下游实验，比如：逆转录、Northern Blot 等。

1.  洗脱后的 RNA 有盐离子残留。

建议：确认漂洗液RW中添加了正确体积的乙醇，并按操作说明的离心转速进行2次RW洗涤吸附柱 （见操作步骤第6，7步）。

2.  洗脱后的 RNA 有乙醇残留。

RNA提取技术问题