植物类囊体膜提取试剂盒         Ver.731075

● 产品简介：

叶绿体（Chloroplast）是质体的一种, 是高等植物和一些藻类所特有的能量转换器，是光合作用的反应场所。在高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜，长径5~10μm，短径2~4μm，厚2~3μm。高等植物的叶肉细胞一般含50～200个叶绿体，可占细胞质的40%，叶绿体的数目因物种细胞类型，生态环境，生理状态而有所不同。叶绿体由叶绿体被膜(chloroplast envelope)、类囊体(thylakoid)和基质(stroma)三部分组成，含有3种不同的膜：外膜、内膜、类囊体膜和3种彼此分开的腔：膜间隙、基质和类囊体腔。类囊体膜上含有光合色素和电子传递链组分，光反应在此上进行，因此类囊体膜也称光合膜。

本公司的植物类囊体膜提取试剂盒采用差速离心方法，可以从植物中提取到高纯度的类囊体膜样品。

1. 即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。

2. 每次处理30 g叶片计算，本产品可使用8-10次提取，每次能得到8-10 mg左右类囊体膜样品。

3. 已经成功用于拟南芥，绿萝，菠菜，豌豆，烟草等植物，还可用于更多植物（可能需要优化条件）。

● 贮存及运输：

4-8℃保存，至少一年有效；试剂盒常温运输。

● 产品组成：

● 使用说明：

注意：类囊体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用器皿和

溶液均需要在4℃预冷。离心时一定要在4℃进行，离心力以g而不是rpm计算。如果需要研究类囊体膜的功能，提取过程还需要在昏暗的光线条件下进行。

需要自备材料：

剪刀；50 ml尖底或圆底离心管；15 ml尖底或圆底离心管；匀浆机；低温离心机。

1.1 材料预处理：

叶片在实验前需先用自来水洗净，再用蒸馏水淋洗，去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理，则保存时需要保持叶片湿润，即使如此，叶片采集后的放置时间也不能超过一天。

1.2  1×类囊体膜提取缓冲液（即用型）配制：

注：一个30克样品提取反应需要 120 ml 1×类囊体膜提取缓冲液（即用型）。

1.3 叶片匀浆：

1.3.1 新鲜采集植物叶片（约30克），快速去除叶脉并将叶片剪成1-3 cm²大小的碎片并浸泡在120 ml的预冷的1×类囊体膜提取缓冲液（即用型）中（每克叶片加4 ml）。

1.3.2 将浸泡了叶片的溶液转移到电动匀浆机（即家用制备果汁的匀浆机，可选货号：RT-2243A）中，低速匀浆5秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入匀浆机底部后，再低速匀浆5秒。注意：除电动匀浆机外，还可以选择玻璃匀浆器和研磨（加玻璃珠）等裂解细胞的方法，但这些方法的单次处理量都比较小，需要将样品分成很多小份单独匀浆，然后再汇集。注：不要用液氮研磨，会损伤类囊体膜；不要过度匀浆，把叶片打碎即可，否则会降低类囊体膜得率。

1.3.3过滤匀浆液：2层过滤纸放于漏斗上，用漏斗将滤液收集到预冷的250 ml量筒中，一般分三次收集，总共可收集80-85 ml滤液，将滤液等分到4个预冷的50 ml的塑料离心管中（每个管中的滤液不要超过35 ml）。

1.4类囊体膜收集：

  4℃ 4200 g离心15分钟，小心弃上清，沉淀即为类囊体膜。

1.5 类囊体膜漂洗：

1.5.1 在类囊体膜沉淀中加入1 ml 预冷的类囊体膜漂洗液，手弹离心管底部使沉淀重悬；再补加1 ml预冷的类囊体膜漂洗液，彻底重悬沉淀。

注：重悬时最好避免溶液起泡，手指轻弹，不要用枪头吹打，否则容易损伤类囊体膜。

1.5.2  4度10000 g离心2分钟，弃上清，保留沉淀。

1.6 类囊体膜重悬：

1.6.1  沉淀中加入1 ml的类囊体膜溶解液，手弹离心管底部使沉淀重悬；再补加1 ml预冷的类囊体膜溶解液，彻底重悬沉淀。

1.6.2  4℃10000 g离心2分钟，上清为可溶性蛋白（根据实验需要保留），沉淀为类囊体膜组分。

1.6.3 沉淀中加入1 ml类囊体膜溶解液，轻柔重悬沉淀，合并4管溶液，即为最终得到的类囊体膜溶液，约4 ml。

1.7 类囊体膜溶液定量：

通常类囊体膜蛋白含量用单位叶绿素含量来表示，即x μg 叶绿素/ml 类囊体膜溶液。

1.7.1 取5 μl 类囊体膜溶液加入到995 μl 80%丙酮溶液中，混匀。

1.7.2 10000 g 4℃离心2分钟，吸取上清，测定OD₆₆₃和OD₆₄₆ 吸光值，用80%丙酮做空白对照。

1.7.3 根据以下公式计算叶绿素：

叶绿素浓度（μg Chl/ml）=200×（17.32×OD₆₄₆+7.18×OD₆₆₃） 注：200为稀释倍数。

1.8 类囊体膜贮存：

将类囊体膜样品用类囊体膜溶解液稀释到浓度为1mg Chl/ml，根据需要适量分装，如50 μl/管，-80℃保存。

1.9 类囊体膜样品溶解和电泳：

类囊体膜增溶缓冲液配制：

将2.5 ml增溶缓冲液（2×）全部加入到增溶剂粉末中，加入灭菌水定容至5 ml，彻底混匀，即配成5 ml增溶缓冲液，适量分装，-20℃贮存，尽量避免反复冻融。

1.9.1 取50 μl(浓度为1 mg Chl/ml)类囊体膜样品, 4℃ 16000 g离心5分钟，弃上清。

1.9.2 沉淀中加入50 μl类囊体膜增溶缓冲液重悬样品（此时样品浓度为1 mg Chl/ml），轻柔混匀，避免产生大量气泡，冰浴10 min； 4℃ 16000 g离心15 min；上清为绿色，有微量沉淀。 注：如上清为无色，说明增溶不好。

1.10

 实验示例：