植物叶绿体DNA提取试剂盒        

● 产品简介：

叶绿体（Chloroplast）是质体的一种, 是高等植物和一些藻类所特有的能量转换器，是光合作用的反应场所。在高等植物中叶绿体为双凸或平凸透镜，长径5~10μm，短径2~4μm，厚2~3μm。高等植物的叶肉细胞一般含50～200个叶绿体，可占细胞质的40%，叶绿体的数目因物种细胞类型，生态环境，生理状态而有所不同。叶绿体由叶绿体外被(chloroplast envelope)、类囊体(thylakoid)和基质(stroma)三部分组成，含有3种不同的膜：外膜、内膜、类囊体膜和3种彼此分开的腔：膜间隙、基质和类囊体腔。

叶绿体DNA（Chloroplast DNA，cpDNA），存在于叶绿体内，高等植物叶绿体的DNA为双链共价闭合环状分子，其长度随生物种类而不同，其大小在120 kb到217 kb之间，相当于噬菌体基因组的大小双链环状，一个叶绿体含有10~50个cpDNA。

本试剂盒是结合植物叶绿体纯化试剂盒和离心柱式植物DNA提取试剂盒而推出的新产品，专门用于植物叶绿体DNA的快速提取。

1. 纯度高，不含污染和抑制剂，可以直接用于酶切、PCR、real-time PCR、 multiplex PCR、RAPD、RFLP、AFLP、Southern Blotting, microsatellite analysis等各种后续分子生物学实验。

2. 以每次处理30 g叶片计算，本产品可使用8-10次提取植物叶绿体，每次能得到3-5 mg左右叶绿体。按照每次使用0.2 ml 叶绿体溶液计算，可以至少提取50次叶绿体DNA的纯化。cpDNA 产率一般在1-2 μg/1 g叶片样品。OD260/280一般在1.8以上。DNA片段长度一般在40-50 Kb左右。

3. 已经成功用于菠菜，大豆，莴笋，白菜，烟草和甜菜等双子叶植物，也适用于单子叶等其他植物（可能需要优化条件）。

● 贮存及运输：

4-8℃保存，至少一年有效；试剂盒常温运输。

● 产品组成：

● 使用说明：

一 植物叶绿体提取：

注意：叶绿体对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用器皿和溶液均需要在4℃预冷。叶绿体提取过程中离心时一定要在4℃进行，离心力以g而不是rpm计算。如果需要研究叶绿体的功能，提取过程还需要在昏暗的光线条件下进行。

需要自备材料：

剪刀；50 ml尖底或圆底离心管；15 ml尖底或圆底离心管；漏斗；匀浆机；低温离心机。

1.1 材料预处理：

实验前1-2天将植物放在暗室培养以减少叶绿体中淀粉颗粒的形成，否则离心时这些颗粒很容易使叶绿体破裂。叶片在实验前需先用自来水洗净，再用蒸馏水淋洗，去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理，则保存时需要保持叶片湿润，即使如此，叶片采集后的放置时间也不能超过一天。

1.2  1×叶绿体提取缓冲液（即用型）配制：

注：一个30克样品提取反应需要 150 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）。

1.3 叶片匀浆：

1.3.1 新鲜采集植物叶片，快速去除叶脉（约30克）并将叶片剪成1-3 cm²大小的碎片并浸泡在150 ml的预冷的1×叶绿体提取缓冲液（即用型）中（每克叶片加5 ml）。

1.3.2 将浸泡了叶片的溶液转移到匀浆机（货号：RT-2243A）中，低速匀浆10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入匀浆机底部后，再低速匀浆10秒，重复10秒匀浆3-4次至叶片破碎即可，不要过分匀浆，否则会降低完整叶绿体的得率。

1.3.3 用2层过滤纸置于小漏斗上，将匀浆液过滤收集到预冷的250 ml量筒中，一般更换三次滤纸可收集约120 ml滤液，将滤液等分到4个预冷的50 ml的塑料离心管中（每个管中的滤液不要超过35 ml）。

1.4 离心去杂质：

4℃ 200 g离心5分钟，保留上清，沉淀为未破裂植物组织、细胞或细胞核（下图）；如果样品中淀粉含量较高，沉淀可能为白色。

注：此步骤用低速离心去除杂质，不能省略，否则得到的叶绿体DNA中会有核基因组的污染。

1.5 收集叶绿体粗提液：

1.5.1将步骤1.4得到的上清液平分到4个预冷的50 ml塑料离心管中；4℃ 1100 g离心15分钟，小心弃上清，沉淀含叶绿体，呈深绿色（下图）。

1.5.2 在沉淀中加入1.5 ml 预冷的1×叶绿体提取缓冲液（即用型），手弹离心管底部使叶绿体重悬，收集4管溶液（约6 ml），此溶液即为叶绿体粗提产物。

1.5.3 如果对叶绿体DNA是否含细胞核DNA的要求不高，则叶绿体粗提液可以直接用于叶绿体DNA纯化（步骤2.1）。

1.6 完整叶绿体的纯化：

叶绿体重悬液配制

1.6.1 单梯度分离法（适合菠菜，白菜，莴苣，拟南芥，绿萝等）：

1.6.1.1 40%密度梯度液配制-10 ml：

在15 ml离心管中加入6 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）和4 ml密度梯度分离试剂，充分混合均匀，得40%密度梯度液，冰浴备用。

1.6.1.2将10 ml 40%密度梯度液平分到2个 15 ml离心管中，每管5 ml；将步骤1.5.2得到的叶绿体粗提液3 ml小心铺在5 ml密度梯度液之上；另一管重复。（5 ml 40%密度梯度液用可以分离3 ml 叶绿体粗提液，其他体积以此比例换算）。

1.6.1.3  4℃ 3200 g离心30分钟，绿色沉淀为完整叶绿体（下图）。

注：如果最上层的分离试剂不够清亮，可以延长离心20分钟。

1.6.1.4 小心弃上清，保留沉淀，每管沉淀中加入1 ml 叶绿体重悬液，轻柔重悬，可以收集到2 ml完整叶绿体溶液。

1.6.1.5 此叶绿体溶液可以提取得到无细胞核DNA污染的叶绿体DNA  

（步骤2.1）。

1.6.2双梯度分离法（适合烟草，甜菜，豌豆等）：

1.6.2.1 80%密度梯度重液配制-4 ml：

在15 ml离心管中加入0.8 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分离试剂，充分混合均匀，得80%密度梯度重液。

1.6.2.2 40%密度梯度轻液配制-8 ml：

在另一15 ml离心管加入4.8 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分离试剂，充分混合均匀，得40%密度梯度轻液。

1.6.2.3 取一只15 ml离心管，加入1.86 ml 80%密度梯度重液，随后取3.74 ml 40%密度梯度轻液小心铺在80%密度梯度重液之上，冰浴备用；然后取步骤1.5.2得到的3 ml叶绿体粗提液小心铺在密度梯度轻液之上。另一管重复。

注：每5.6 ml 40%/80%密度梯度液可以分离3 ml 叶绿体粗提液；其他体积按照比例调整。

1.6.2.4 4℃ 3200 g离心30分钟，上层绿色带含破碎的叶绿体、线粒体和核糖体等，重液和轻液间的绿色带为完整叶绿体（下图）。

注：如果最上层的分离试剂不够清亮，可以延长离心20分钟。

1.6.2.5 重悬叶绿体：

用广口吸管小心将重液和轻液之间的绿色带（完整叶绿体）转  移到新的15 ml离心管中，加入三倍体积预冷的叶绿体重悬液，轻柔混匀。

1.6.2.6 离心收集叶绿体：

4℃ 1750 g离心6分钟，小心将上清倒出后，在绿色的叶绿体沉淀中加入预冷的1 ml叶绿体重悬液，手指轻弹管底使叶绿体重悬。最终可以收集到2 ml完整叶绿体溶液。

1.6.2.7此叶绿体溶液可以提取得到无细胞核DNA污染的叶绿体DNA（步骤2.1）。

1.7 叶绿体贮存：

叶绿体可在显微镜下检查叶绿体完整性。叶绿体重悬液避光-80℃保存。叶绿体必须尽快使用，否则非常容易失去活性。

1.8 叶绿素含量测定：

通常叶绿体含量用单位叶绿素含量来表示，即x mg 叶绿素/ml 叶绿体悬浮液。

1.8.1 取10 μl 叶绿体悬浮液加入到990 μl 80%丙酮溶液中，混匀。

1.8.2 3000 g 离心5分钟，取上清测定OD₆₅₂ 吸光值，用80%丙酮做空白对照。

1.8.3 根据以下公式计算叶绿素：

叶绿素浓度（mg/ml）=（OD₆₅₂×100）/36

100：稀释倍数

36：extinction coefficient in ml/cm·mg

二 叶绿体DNA提取：

注：以下离心操作可以常温下进行。

2.1 取0.2-0.4 ml叶绿体溶液，3500 g离心2分钟，小心弃上清，沉淀为叶绿体。

   注：可以根据提取的叶绿体浓度大体估算提取到的cpDNA浓度。经验值：每50 μg 叶绿体（叶绿素浓度）可以提取到1μg cpDNA。

2.2叶绿体沉淀中加入400 μl 缓冲液AP1和6 μl RNaseA (10mg/ml)，漩涡震荡1分钟。

2.3 将离心管放在65℃水浴10分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

2.4 加入130 μl 缓冲液AP2，颠倒混匀，冰浴5分钟。

2.5 12,000 rpm离心5分钟，保留上清，上清通常为无色，沉淀为绿色。注：此步骤离心去除去垢剂，蛋白以及多糖等杂质。

2.6 将上清（通常可取到400 μl）转移到1.5 ml离心管中，加入1.5倍体积（例如400 μl的上清液加600 μl）缓冲液AP3（使用前请注意是否已经加入无水乙醇），立即颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

2.7吸取步骤2.6中的混合液加入到吸附柱CG中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm离心1分钟，倒掉废液，吸附柱CG放回收集管中。

注：离心吸附柱的最大容积是700 μl，如果一次不能完全上柱，可以分次上柱离心，保证全部溶液全部加到离心柱中。

2.8向吸附柱CG中加入700 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉废液，吸附柱CG放入收集管中。

2.9向吸附柱CG中加入500 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉废液，吸附柱CG放入收集管中。

2.10将吸附柱CG放回废液收集管中，12,000 rpm离心2分钟。

注：此步骤非常重要，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

2.11将吸附柱CG转入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100 μl经65℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000 rpm g离心2分钟。

注：洗脱缓冲液体积不要少于50 μl，体积过小影响回收效率；洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。

2.12  叶绿体DNA产物-20℃保存。

三 实验示例：

3.1 叶绿体提取示例：

30克绿萝叶片，加入150 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）  匀浆5×10秒，3次过滤共收集120 ml过滤液，平分4管，4℃ 1100 g 离心15 min，弃上清，每管重悬于1.5 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）中，共得到6 ml 叶绿体粗提液。2×3 ml 粗提液平铺于2×5 ml 40%密度梯度液之上，4℃ 3200 g离心15分钟，弃上清，每管沉淀重悬于1 ml 叶绿体重悬液中，共得到2 ml精制叶绿体重悬液，测定叶绿素含量为3.43 mg/ml重悬液。30克叶片提取得到6.86 mg叶绿体。取10 μl叶绿体溶液稀释20倍，取50 μl稀释液显微镜40倍物镜观察，如下图。

3.2 叶绿体DNA电泳示例：

叶绿体提取同3.1。取100 μl叶绿体重悬液，提取cpDNA，最后用50 μl洗脱，上样5 μl，电泳结果见下图左二泳道，cpDAN大小约20kb，无可见核基因组污染。