柱式植物叶绿体提取试剂盒  (微量样品)      

● 产品简介：

叶绿体（Chloroplast）是质体的一种, 是高等植物和一些藻类所特有的能量转换器，是光合作用的反应场所。在高等植物中叶绿体为双凸或平凸透镜，长径5~10μm，短径2~4μm，厚2~3μm。高等植物的叶肉细胞一般含50～200个叶绿体，可占细胞质的40%，叶绿体的数目因物种细胞类型，生态环境，生理状态而有所不同。叶绿体由叶绿体外被(chloroplast envelope)、类囊体(thylakoid)和基质(stroma)三部分组成，含有3种不同的膜：外膜、内膜、类囊体膜和3种彼此分开的腔：膜间隙、基质和类囊体腔。本公司的植物叶绿体提取试剂盒采用密度梯度离心方法，可以从多种植物中提取高纯度的叶绿体。

1. 即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。

2. 不需要液氮研磨叶片，可以从50-100 mg材料中提取叶绿体，方便使用。

3. 试剂盒可以用于叶绿体粗提，所得叶绿体含少量其他细胞器污染，可用于后续的SDS-PAGE，Western，ELISA和蛋白组分析。也可以用于叶绿体精提，所得叶绿体完整，可用于后续的光合作用，电子链和磷酸化，跨膜转运，体外叶绿体蛋白合成，蛋白定位等研究。还可用于叶绿体膜，基质，类囊体的提取以及叶绿体DNA和叶绿体RNA纯化。

4. 以每次处理0.1 g叶片计算，本产品可使用50次提取，每次能得到20-30 μg叶绿体（叶绿素定量）。

5. 已经成功用于拟南芥，绿萝，菠菜，大豆，莴笋，白菜，烟草和甜菜等植物，还可用于更多植物（可能需要优化条件）。

   注：本产品适合于少量叶片（50-100 mg）叶绿体的提取，大量叶片叶绿体提取（每次处理30 g叶片）请选择RTU5001 植物叶绿体提取试剂盒。

● 贮存及运输：

4-8℃保存；有效期一年；试剂盒常温运输。

● 产品组成：

● 使用说明：

注意：叶绿体对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用器皿和溶液均需要在4℃预冷。离心时一定要在4℃进行，离心力以g而不是rpm计算。如果需要研究叶绿体的功能，提取过程还需要在昏暗的光线条件下进行。

需要自备材料：

剪刀；1.5 离心管；低温离心机。

一 叶绿体提取：

1.1 材料预处理：

实验前1-2天将植物放在暗室培养以减少叶绿体中淀粉颗粒的形成，否则离心时这些颗粒很容易使叶绿体破裂。叶片在实验前需先用自来水洗净，再用蒸馏水淋洗，去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理，则保存时需要保持叶片湿润，即使如此，叶片采集后的放置时间也不能超过一天。

1.2 叶片研磨：

1.2.1 取50-100 mg新鲜采集植物样品（叶片，软茎等），剪成1-3 cm²大小的碎片放入离心柱内。

注：样品质量尽量控制在100 mg以内，有利于后续充分研磨。

1.2.2 加入0.1 ml 预冷的提取缓冲液，用塑料研磨棒向下挤压旋转研磨样品20-30次（大约用时1-2分钟），至样品无可见大块组织碎片，再补加0.3 ml 提取缓冲液，用吸头混匀。

注：塑料研磨棒可以水洗后重复使用。

1.3 离心去杂质：

盖好2 ml收集管管盖，4℃ 2000 g（约4600 rpm）离心 5分钟。

1.4 粗叶绿体提取：

1.4.1 弃离心柱，吸头吸弃离心管内上清，保留沉淀。

注：如沉淀离心后不实，可以重悬沉淀后再次离心收集沉淀。

1.4.2 沉淀中加入0.1 ml漂洗缓冲液，轻轻重悬，溶液即为叶绿体粗提液。

注：100 mg叶片提取的粗叶绿体，溶于0.1 ml漂洗缓冲液中，叶绿体浓度约为0.6-1 μg Chl/μl（叶绿体浓度测定见步骤1.6），可以将多管叶绿体溶液4℃ 4200 g 离心5分钟，合并叶绿体沉淀，用漂洗缓冲液将叶绿体浓度调整为 1 μg Chl/μl（1 mg Chl/ml），分装为50 μl每只，-80℃贮存。

1.5 精制叶绿体提取：

1.5.1即用型梯度分离液配制：

在干净的1.5 ml离心管中加入0.4 ml 密度梯度分离试剂和0.6 ml漂洗缓冲液，涡旋彻底混匀。

1.5.2 将步骤1.4.2的0.1 ml叶绿体粗提液缓慢加入到即用型梯度分离液上方。

1.5.3 4℃ 4200 g（约6600 rpm）离心10分钟，小心弃上清，沉淀为精制叶绿体。

1.5.4 在沉淀中加入0.5 ml 漂洗缓冲液，轻柔重悬沉淀。

1.5.5 4℃ 4200 g（约6600 rpm）离心5分钟，弃上清，保留沉淀。

1.5.6沉淀中加入0.1 ml漂洗缓冲液，轻轻重悬，溶液即为精制叶绿体。

注：100 mg叶片提取的精制叶绿体，溶于0.1 ml漂洗缓冲液中，叶绿体浓度约为0.3-0.7 μg Chl/μl（叶绿体浓度测定见步骤1.6），可以将多管叶绿体溶液4℃ 4200 g 离心5分钟，合并叶绿体沉淀，用漂洗缓冲液将叶绿体浓度调整为 1 μg Chl/μl（1 mg Chl/ml），分装为50 μl每只，-80℃贮存。

1.6 叶绿素含量测定：

通常叶绿体含量用单位叶绿素（Chl）含量来表示，即x mg Chl/ml 叶绿体悬浮液。

1.6.1 取10 μl 叶绿体悬浮液加入到990 μl 95%乙醇溶液中，混匀。

1.6.2测定OD₆₄₉和OD₆₆₅ 吸光值，用95%乙醇做空白对照。

1.6.3 根据以下公式计算叶绿素：

叶绿素浓度（mg/ml）=100×（18.16×OD₆₄₉+6.63×OD₆₆₅）

100：稀释倍数

二. 叶绿体的使用：

2.1 叶绿体功能研究：

如果用于完整叶绿体的功能或酶活性研究，初始100 mg样品分离得到的叶绿体样品调整叶绿体浓度为1 μg Chl/μl，50 μl/管分装， -80℃贮存备用。不建议长期贮存，尽快使用。

2.2 叶绿体蛋白电泳：

2.2.1叶绿体蛋白变性样品处理：

2.2.1.1 取50 μl叶绿体溶液（1 μg Chl/μl）；

2.2.1.2 4℃ 4200g 离心5分钟，弃上清，沉淀中加入SDS-PAGE上样缓冲液（货号：PL080，PL113，PL121）处理，建议调整上样液浓度为0.5 μg/μl；对于多次跨膜蛋白（Multi-pass membrane protein）的变性电泳检测，样品建议使用37℃处理30分钟，不要95℃加热5分钟，因为在95℃高温情况下，多次跨膜蛋白极易聚集形成多聚体，样品会聚集，WB检测会表现为比实际蛋白大小更大的分子量；

2.2.1.3 使用SDS-PAGE凝胶（货号：RTD6132，RTD6116）电泳，每个泳道上样10-40 μl（5-20 μg）。

2.2.2 叶绿体蛋白BN非变性样品处理：

2.2.2.1取50 μl叶绿体溶液（1 μg Chl/μl）；；

2.2.2.2 4℃ 4200g 离心5分钟，弃上清，沉淀中加入50 μl 类囊体膜增溶缓冲液，轻柔重悬沉淀，尽量不产生气泡，冰浴10分钟；

2.2.2.3 4℃ 16000 g 10分钟，取上清至一干净1.5 ml离心管中即为增溶后叶绿体蛋白溶液（小心不要吸取沉淀），此时得到的叶绿体蛋白浓度为1 μg/μl，其中去垢剂DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）终浓度为2%；

2.2.2.4 叶绿体蛋白溶液中加入1/10体积类囊体膜上样缓冲液（10×），使用BN凝胶电泳（货号：RTD6139，RTD6140），每个泳道上样5-20 μg。

2.2.3 叶绿体蛋白等电聚焦样品处理（2D凝胶第一维电泳）：

建议叶绿体沉淀中使用溶解液：7 M尿素，2 M硫脲，2%CHAPS，20 mM DTT(自备，试剂盒不提供)。

三 实验示例：

程序：取0.1克新鲜绿萝叶片加入到离心柱内，加入0.1 ml提取缓冲液，研磨20次，再加入0.3 ml提取缓冲液（平行做6管）；4度 2000g 离心5分钟；弃上清，沉淀中加入0.1ml漂洗缓冲液，合并6管得到0.6 ml粗叶绿体，保留0.2ml粗叶绿体。取0.1ml粗叶绿体加到1ml即用型梯度分离液上层（0.4 ml密度梯度分离试剂加0.6ml漂洗缓冲液），平行做4管；4度 4200g 离心10分钟，弃上清，沉淀中加入0.5ml漂洗液清洗一次，4度 4200g 离心5分钟，4管精制叶绿体沉淀合并收集于0.1ml漂洗液中。用乙醇方法测定叶绿体浓度，调整粗叶绿体和精制叶绿体浓度均为1μg Chl/μl；取50μl叶绿体溶液，离心，沉淀中加入50 μl类囊体膜增溶缓冲液，冰浴10分钟，4度 16000g 离心10分钟取上清，加入1/10体积类囊体膜上样缓冲液（10×），此时叶绿体蛋白浓度为1μg/μl，上样10 μl和20 μl。

电泳：RTD6138-0312  3-12%BN胶，1×BN buffer+0.02%G-250，200V 15-3.5mA 50 min

更换1×无色BN buffer 200V继续电泳，时间共103 min，FastBlue蛋白染色液染色30分钟。