2×ligation solution MasterMix
2×DNA连接缓冲液
● 产品组成：
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货号
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名称
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规格
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RTV701
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2×ligation solution MasterMix
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150 μl
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注；按照10μl连接体系计算，每次使用5μl，可以使用30次。
● 保存：-20℃
● 产品简介：
2×ligation solution MasterMix是含有T4 DNA Ligase，ligation buffer的2×MasterMix，实验时，只需加入片段和载体即可进行连接反应。
适用于DNA片段和载体DNA的连接以及DNA片段和Linker或Adaptor DNA的连接。
● 注意事项
1．2×ligation solution MasterMix由于含有T4 DNA ligase，使用前冰浴中彻底融化，混匀后使用。
2．为了提高转化效率，转化时建议所加入连接产物的量不要超过感受态细胞体积的10%。
● 使用方法：
一 DNA片段和载体DNA的连接
1）粘性末端的连接
1．反应体系:
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10μl体系
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终浓度
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线性载体DNA
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：载体=1:1-5:1*
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng（0.025pmol），10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。
2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反应条件：16℃孵育30分钟。
4．可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。
注：1）若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后进行电击转化。
2）若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。
2）平末端的连接
1．反应体系:
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10μl体系
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终浓度
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线性平末端载体DNA*
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：载体=1:1-5:1**
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：平滑末端的载体与 DNA 片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。
**：载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng（0.025pmol），10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。
2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反应条件：16℃孵育30分钟。
4．可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。
注：1）若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。
2）若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。
二 线性DNA的自身环化
1．反应体系:
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10μl体系
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终浓度
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线性载体DNA
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x μl
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10-50 ng
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反应条件：16℃孵育30分钟。
4．可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。
注：1）若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。
三 接头连接
1．反应体系:
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10μl体系
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终浓度
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线性DNA
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x μl
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100-300 ng
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磷酸化接头
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y μl
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0.5-1 μg
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反应条件：16℃孵育30分钟。
4．65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase。连接产物可以直接进行限制性内切酶酶切反应。