Western一抗二抗去除液（弱碱，温和型）

● 产品简介：

Western一抗二抗去除液（弱碱，温和型）(Western Antibody Stripping Buffer，weak alkaline，mild type)可以高效去除印迹膜上的一抗和二抗，而吸附在膜上的抗原基本不受影响，用于Western中转移了蛋白膜的重复利用，可以转一次膜，做多次Western印迹实验，通常可以重复利用膜5-8次（PVDF膜）。使用本试剂只需大约30分钟即可实现蛋白膜的重复使用，然后可以进行Western的后续操作。

该产品具有以下几个优点：

1.可用于昂贵或珍稀样本的多次杂交；

2.有利于用不同抗体分析单次印迹上的不同蛋白，比如不同亚型的抗体；

3.有利于对异常结果进行重新分析或确认；

4.有利于纠正孵错的抗体；

5.节约试剂成本，并节约时间。

各种去除液的选择请点击Western一抗二抗去除液选择指南。

● 贮存：

   常温贮存，有效期一年；常温运输。

● 用前必读：

1. 理想的抗体去除液应该是洗脱抗体的同时，不洗脱膜上结合的蛋白或者不改变抗原的结合性质，但是目前没有一种去除液可以做到只洗脱抗体，而完全不洗脱膜上结合的抗原；也没有一种去除液可以适用于所有不同亲和度的抗原抗体复合物。去除液洗脱能力太强，抗原也容易被洗脱；太弱，则抗体残留太高。因此，从免疫印迹膜上去除抗体的方案仅能用于定性用途，因为在每个抗体清除循环中，或多或少都将洗去少量膜上的蛋白。

2. PVDF膜比硝酸纤维素膜（NC膜）更坚韧，因此优先推荐使用PVDF膜用于涉及抗体剥离的实验。

3. 从SDS-PAGE凝胶转印完成后立即干燥PVDF膜或NC膜，可改善蛋白质与膜的结合，特别推荐用于涉及多次抗体剥离的实验。在第一轮抗体检测之前，必须使用甲醇将干燥的PVDF膜润湿或用1×TBST将干燥的NC膜润湿。已经结合有抗体的膜，决不能使得膜干燥，否则抗体分子将与膜结合紧密，很难剥离。因此，在做完一轮ECL发光检测实验后，需要用清除液清除掉膜上的抗体，推荐将膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。

4. 检测时，优先检测低丰度抗原：先孵育条带较弱（表达较低）的蛋白，再孵育条带明显（表达较高）的蛋白，最后再孵育内参。

5. 如条件允许，下一轮的抗体杂交实验选择种属来源不同的一抗（对应不同种属的二抗），减少检测的交叉反应。

6. 该清除液适用于ECL发光检测的膜上抗体清除，不适合于膜上直接显色（DAB，BCIP/NBT等），不适合荧光检测。

● 使用说明：

1. 在完成Western化学发光检测后，NC膜或PVDF膜用适量蒸馏水中震荡漂洗5分钟；重复漂洗2次。

2. 弃蒸馏水，加入适量的Western一抗二抗去除液，根据下表操作。孵育温度和时间会明显影响抗体去除效果，参照下表调整。

3. 弃去除液，加入足量蒸馏水，在摇床上漂洗2次，每次5分钟，把去除液彻底漂洗干净。

  注：残余的去除液会影响后续抗原抗体的的结合。

4. 可选步骤：漂洗后的转印膜孵育ECL发光液，检测二抗的清除效率。曝光5-10分钟，膜上看不到发光条带表明二抗清除得比较干净。如果膜上能看到条带，重复步骤2-3。

5．继续进行Western的后续操作（封闭-抗体孵育-发光检测）。

   注：建议每次膜剥离后都要进行重新封闭，以降低背景。

● 实验示例：

样品：K562细胞,SDS裂解液（货号：RL1060）提取总蛋白；

电泳：4-20% RealPAGE预制胶（货号：RTD6117-0420）电泳

转膜：NC膜，1×RealBlot快速转膜液（货号：RT5020）快速湿转，恒流400 mA 30 min

图1：Western快速封闭液（货号：WR5020）RT 快封  15 min；一抗：β-Actin鼠单抗 1:10000  RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min；ECL（货号：EC2520）曝光1秒。

图2： Western一抗二抗去除液（弱碱，温和型） RT 20分钟剥离，ECL曝光11分钟，二抗去除干净。

图3： Western快速封闭液（货号：WR5020）RT 快封20分钟；一抗：PCNA鼠单抗1：5000 RT 60min，二抗羊抗鼠IgG-HRP 1:5000，ECL（货号：EC2520）曝光1秒。

图4： 膜第二次剥离RT 30分钟，ECL自动曝光11min ，二抗去除干净

图5： Western快速封闭液（货号：WR5020）RT 快封30min；一抗：GAPDH兔多抗 1:3000 60min，二抗：羊抗兔IgG-HRP RT 60min，ECL曝光2分16秒。

Western一抗二抗去除液（弱碱，温和型） PVDF膜测试

样品：K562细胞,SDS裂解液(货号：RL1060)提取总蛋白

电泳条件：12% RealPAGE预制胶（货号：RTD6117-0012）， 恒压150 V 1×TGS  73 min

转膜条件：PVDF膜 孔径0.45μm，1×RealBlot快速转膜液（货号：RT5020） 恒流400 mA 30 min

封闭：无蛋白快速封闭液（货号：PF1070）常温封闭10 min

膜去除抗体程序：37度，摇床60rpm 10分钟

图1：一抗：PCNA鼠单抗 1:5000，RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min，ECL曝光1秒

图2：膜第1次清除后抗体去除效果检测：膜水漂洗3次，加入5 ml抗体去除液去除抗体，TBST漂洗3次，ECL曝光5分钟，膜上几乎无可见条带，说明二抗去除干净。

图3：膜第1次清除后，H3检测： H3鼠单抗 1:10000  RT  60 min孵育，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育，ECL曝光5秒。

图4：膜第2次清除后，GAPDH检测： GAPDH兔多抗 1:3000  RT 60 min孵育，羊抗兔IgG-HRP 1:5000  RT 60min，ECL曝光150秒。

图5：膜第3次清除后，PCNA检测：PCNA鼠单抗 1:5000  RT  60 min孵育，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育，ECL曝光1秒。