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Western一抗二抗去除液(弱碱,温和型)

Western一抗二抗去除液(弱碱,温和型)

产品编号:WS1200-500ml

产品规格:500ml

相关规格:
数量
价格 ¥300

Western一抗二抗去除液(弱碱,温和型)

货号

名称

规格

WS1200-100ml

Western一抗二抗去除液(弱碱,温和型)

100 ml

WS1200-500ml

Western一抗二抗去除液(弱碱,温和型)

500 ml







● 产品简介:

Western一抗二抗去除液(弱碱,温和型)(Western Antibody Stripping Buffer,weak alkaline,mild type)可以高效去除印迹膜上的一抗和二抗,而吸附在膜上的抗原基本不受影响,用于Western中转移了蛋白膜的重复利用,可以转一次膜,做多次Western印迹实验,通常可以重复利用膜5-8次(PVDF膜)。使用本试剂只需大约30分钟即可实现蛋白膜的重复使用,然后可以进行Western的后续操作。

该产品具有以下几个优点:

1.可用于昂贵或珍稀样本的多次杂交;

2.有利于用不同抗体分析单次印迹上的不同蛋白,比如不同亚型的抗体;

3.有利于对异常结果进行重新分析或确认;

4.有利于纠正孵错的抗体;

5.节约试剂成本,并节约时间。

各种去除液的选择请点击Western一抗二抗去除液选择指南

● 贮存:

   常温贮存,有效期一年;常温运输。

● 用前必读:

1. 理想的抗体去除液应该是洗脱抗体的同时,不洗脱膜上结合的蛋白或者不改变抗原的结合性质,但是目前没有一种去除液可以做到只洗脱抗体,而完全不洗脱膜上结合的抗原;也没有一种去除液可以适用于所有不同亲和度的抗原抗体复合物。去除液洗脱能力太强,抗原也容易被洗脱;太弱,则抗体残留太高。因此,从免疫印迹膜上去除抗体的方案仅能用于定性用途,因为在每个抗体清除循环中,或多或少都将洗去少量膜上的蛋白。

2. PVDF膜比硝酸纤维素膜(NC膜)更坚韧,因此优先推荐使用PVDF膜用于涉及抗体剥离的实验。

3. 从SDS-PAGE凝胶转印完成后立即干燥PVDF膜或NC膜,可改善蛋白质与膜的结合,特别推荐用于涉及多次抗体剥离的实验。在第一轮抗体检测之前,必须使用甲醇将干燥的PVDF膜润湿或用1×TBST将干燥的NC膜润湿。已经结合有抗体的膜,决不能使得膜干燥,否则抗体分子将与膜结合紧密,很难剥离。因此,在做完一轮ECL发光检测实验后,需要用清除液清除掉膜上的抗体,推荐将膜浸泡于1×TBS(非1×TBST)中4度保存。

4. 检测时,优先检测低丰度抗原:先孵育条带较弱(表达较低)的蛋白,再孵育条带明显(表达较高)的蛋白,最后再孵育内参。


5. 如条件允许,下一轮的抗体杂交实验选择种属来源不同的一抗(对应不同种属的二抗),减少检测的交叉反应。

6. 该清除液适用于ECL发光检测的膜上抗体清除,不适合于膜上直接显色(DAB,BCIP/NBT等),不适合荧光检测。

● 使用说明:

1. 在完成Western化学发光检测后,NC膜或PVDF膜用适量蒸馏水中震荡漂洗5分钟;重复漂洗2次。

2. 弃蒸馏水,加入适量的Western一抗二抗去除液,根据下表操作。孵育温度和时间会明显影响抗体去除效果,参照下表调整。

操作温度

震荡清除时间

备注

18

30分钟以上

冬天实验室气温低时

25

~30 分钟

常规样品操作

推荐37

10-25分钟

膜上蛋白含量高的样品或清除与膜亲和力高的抗体

3. 弃去除液,加入足量蒸馏水,在摇床上漂洗2次,每次5分钟,把去除液彻底漂洗干净。

  注:残余的去除液会影响后续抗原抗体的的结合。

4. 可选步骤:漂洗后的转印膜孵育ECL发光液,检测二抗的清除效率。曝光5-10分钟,膜上看不到发光条带表明二抗清除得比较干净。如果膜上能看到条带,重复步骤2-3。

5.继续进行Western的后续操作(封闭-抗体孵育-发光检测)。

   注:建议每次膜剥离后都要进行重新封闭,以降低背景。

● 实验示例:


样品:K562细胞,SDS裂解液(货号:RL1060)提取总蛋白;

电泳:4-20% RealPAGE预制胶(货号:RTD6117-0420)电泳

转膜:NC膜,1×RealBlot快速转膜液(货号:RT5020)快速湿转,恒流400 mA 30 min

图1:Western快速封闭液(货号:WR5020)RT 快封  15 min;一抗:β-Actin鼠单抗 1:10000  RT 60min;二抗:羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min;ECL(货号:EC2520)曝光1秒。

图2: Western一抗二抗去除液(弱碱,温和型) RT 20分钟剥离,ECL曝光11分钟,二抗去除干净。

图3: Western快速封闭液(货号:WR5020)RT 快封20分钟;一抗:PCNA鼠单抗1:5000 RT 60min,二抗羊抗鼠IgG-HRP 1:5000,ECL(货号:EC2520)曝光1秒。

图4: 膜第二次剥离RT 30分钟,ECL自动曝光11min ,二抗去除干净

图5: Western快速封闭液(货号:WR5020)RT 快封30min;一抗:GAPDH兔多抗 1:3000 60min,二抗:羊抗兔IgG-HRP RT 60min,ECL曝光2分16秒。


Western一抗二抗去除液(弱碱,温和型) PVDF膜测试

样品:K562细胞,SDS裂解液(货号:RL1060)提取总蛋白

电泳条件:12% RealPAGE预制胶(货号:RTD6117-0012), 恒压150 V 1×TGS  73 min

转膜条件:PVDF膜 孔径0.45μm,1×RealBlot快速转膜液(货号:RT5020) 恒流400 mA 30 min

封闭:无蛋白快速封闭液(货号:PF1070)常温封闭10 min

膜去除抗体程序:37度,摇床60rpm 10分钟

图1:一抗:PCNA鼠单抗 1:5000,RT 60min;二抗:羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min,ECL曝光1秒

图2:膜第1次清除后抗体去除效果检测:膜水漂洗3次,加入5 ml抗体去除液去除抗体,TBST漂洗3次,ECL曝光5分钟,膜上几乎无可见条带,说明二抗去除干净。

图3:膜第1次清除后,H3检测: H3鼠单抗 1:10000  RT  60 min孵育,羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育,ECL曝光5秒。

图4:膜第2次清除后,GAPDH检测: GAPDH兔多抗 1:3000  RT 60 min孵育,羊抗兔IgG-HRP 1:5000  RT 60min,ECL曝光150秒。

图5:膜第3次清除后,PCNA检测:PCNA鼠单抗 1:5000  RT  60 min孵育,羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育,ECL曝光1秒。


 
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