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RTD6143明胶酶谱分析试剂盒
 产品货号: RTD6143
 产品名称: RTD6143明胶酶谱分析试剂盒
 产品价格/规格: 50次 1500元
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 更新时间: 2021-05-22
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  • 明胶酶谱分析试剂盒

    货号

    名称

    规格

    RTD6143

    明胶酶谱分析试剂盒

    50


    产品组成:

    货号

    名称

    规格

    保存

    RTD6143-01

    4%浓缩胶聚合溶液A2×)

    40 ml

    4

    RTD6143-02

    4%彩色浓缩胶溶液B2×)

    40 ml

    4

    RTD6143-03

    10%分离胶聚合溶液A2.5×)

    100 ml

    4

    RTD6143-04

    10%分离胶胶溶液B2×)

    125 ml

    4

    RTD6143-05

    10×明胶底物

    30 ml

    RT (配制后-20)

    RTD6143-06

    10×复性缓冲液

    250 ml

    4

    RTD6143-07

    10×孵育缓冲液

    500 ml

    4

    RTD6143-08

    胶原酶阳性对照

    0.5 ml

    -20

    RTD6202

    FastBlue蛋白染色液

    500 ml

    RT

    PL112

    5×蛋白上样缓冲液 (变性,非还原)

    1 ml

    -20

    TG120P

    5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(干粉)

    1 L

    RT

    AP020P

    APS(干粉)

    0.5 g

    RT (配制后-20)

    TA0761

    TEMED

    0.5 ml

    4,避光

    说明书

    一份

    产品简介:

    基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)是一种锌依赖性酶,能切割细胞外基质成分,能在一定条件下水解明胶。细胞内的MMP以无活性的酶原形式分泌,活化后能够降解细胞外基质的胶原蛋白,通过影响细胞外基质,参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程,并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程,其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视。

    本试剂盒采用酶谱法(Zymography)检测MMP-2、MMP-9 活性,其基本原理和程序是:制备含有胶原酶底物明胶的SDS-PAGE 凝胶,含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳,电泳时,SDS与样本中的MMP可逆性结合,导致MMP氢键和疏水键被破坏而不能发挥分解明胶的作用。电泳结束后取出凝胶与孵育溶液孵育,MMP恢复活性,在其迁移位置水解凝胶中的明胶,考马斯亮蓝染色后凝胶中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶条带的位置,蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白,因而不被染色而形成透亮白色区域,从而能同时指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性,其强弱与MMP活性呈正比。

    本试剂盒提供明胶酶谱分析的全套试剂,试剂盒可进行50 次标准胶(8×10 cm)检测,如果小胶加样孔为10~15个,则总计可检测500~750 个样品。试剂盒配套有胶原酶阳性对照,可以有效分解明胶,方便判断凝胶及电泳体系是否有问题。

    贮存及运输:

        按照试剂盒标签贮存;常温运输;开封后试剂盒有效期一年。

    使用说明:

    1. 10% APS配制-5 ml

    将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中,彻底溶解后分装,1 ml/支,-20℃备存,每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间,以防失效。10%APS在4℃有效期为一周,-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长,应考虑更换使用-20度保存的10%APS。

    2. 10×明胶底物配制:

    离心管中加入30 ml灭菌水,60℃水浴中彻底融化,冷却至常温后使用。明胶底物配制后-20℃贮存。

    分离胶制备:

    1.1参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。

    1.2按照表格将不同体积的成分在小烧杯中混合;最后加入10%APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。

     

     

    10%分离胶

    4%浓缩胶

     

     

    5 ml

    1.5 ml

    加入顺序

    组份

    1.0 mm厚度凝胶

    1

    10%分离胶聚合溶液A2.5×

    2.0 ml

    -

    2

    10%分离胶胶溶液B

    2.5 ml

    -

    3

    10×明胶底物

    0.5 ml

    -

    4

    4%浓缩胶聚合溶液A

    -

    0.75 ml

    5

    4%彩色浓缩胶溶液B

    -

    0.75 ml

    6

    10 APS

    50 μl

    15 μl

    7

    TEMED

    5 μl

    1.5 μl

    1.3在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于mini-gel,凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可),然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层无水乙醇,使凝胶表面保持平整。

    1.4静置5-10分钟,待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面后,说明凝胶已聚合

    浓缩胶制备:

    2.1去除覆盖在分离胶上的乙醇层。

    2.2按照表格将不同体积成分在一个小烧杯中混合;最后加入10%过硫酸铵和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。

    2.3将浓缩胶溶液加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。

    2.4将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。

    2.5静置30-60分钟,等待浓缩胶聚合(25℃ 标准凝固时间为50分钟)。

    注:凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时,聚合较快;冬天气温低时,聚合时间会延长。可以根据表格标准条件调节催化剂的加入量。

    电泳:

    3.1 5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液的配制:

       将一包干粉全部倒入1L烧杯中,加入约900 ml水彻底溶解,用水定容至1 L(此溶液不用调节pH值)。电泳前将缓冲液稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。

    3.2 样品处理:融化-混合-上样

    3.2.1 胶原酶IV配制:IV型胶原酶可以有效分解明胶,电泳时可以作为阳性对照。


    3.2.2 将5×蛋白上样缓冲液(变性,非还原)常温融化后混匀。

    3.2.3 将上样缓冲液与蛋白样品按照1:4的比例混匀。

    注:由于MMP活性需要二价阳离子,蛋白样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂以及巯基乙醇和DTT等。

    3.2.4 快甩离心收集到管底,常温放置5-10分钟,不要加热处理样品,上样电泳。

    3.3 电泳:

       在电泳槽的内槽加入1×电泳缓冲液,轻轻拨出梳子,冲洗加样孔,随后在电泳槽外槽加入适量的1×电泳缓冲液。上样,恒电压150 V冰浴电泳。

    电泳条件(一板胶)

    恒电压

    起始电流

    终止电流

    电泳时间

     

    150V

    30-40mA

    8-15mA

    50 min+

    冰浴电泳

    MMP检测:

    4.1 漂洗:

    取出凝胶,放入容器内,加入50 ml蒸馏水漂洗凝胶,摇床慢摇5分钟,重复一次。

    4.2 复性:

    4.2.1  1×复性缓冲液配制:

    将10×复性缓冲液用蒸馏水稀释10倍,如10 ml 10×复性缓冲液加90 ml蒸馏水。

    4.2.2 复性:

    取出凝胶,弃蒸馏水,加入50 ml 1×复性缓冲液,摇床慢摇30分钟。

    注:复性结束后,凝胶呈乳白半透明状。

    4.3 孵育:

    4.3.1 1×孵育缓冲液配制:

    将10×孵育缓冲液用蒸馏水稀释10倍,如10 ml 10×孵育缓冲液加90 ml蒸馏水。

    4.3.2 孵育:

    倒掉1×复性缓冲液,加入50 ml 1×孵育缓冲,37℃ 摇床慢摇10分钟;

         弃1×孵育缓冲液,加入 50 ml 1×孵育缓冲,37℃ 摇床慢摇4小时-过夜孵育。

    注:阳性对照-胶原酶IV通常37℃孵育3-4小时即可消化凝胶中的明胶。如样品中MMP 活性低,应延长孵育时间至过夜。

    4.4 显色:

    4.4.1 漂洗:倒掉孵育液,凝胶中加入50 ml蒸馏水,摇床慢摇5分钟,重复一次。

    4.4.2 弃蒸馏水,加入50-100 ml FastBlue染色液(以刚刚覆盖过胶面为适),摇床上常温摇动30分钟-2小时,凝胶大部分区域被深染,在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9)kDa位置出现透明条带。

    五 实验示例:



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