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2×DNA连接缓冲液 2×ligation solution MasterMix
 产品货号: RTV701
 产品名称: 2×DNA连接缓冲液 2×ligation solution MasterMix
 产品价格/规格: 150ul 150元
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 更新时间: 2018-08-27
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  • 2×ligation solution MasterMix

    2×DNA连接缓冲液

     

      产品组成:

    货号

    名称

    规格

    RTV701

    2×ligation solution MasterMix

    150 μl

    注;按照10μl连接体系计算,每次使用5μl,可以使用30次。

    保存:-20

    产品简介:

    2×ligation solution MasterMix是含有T4 DNA Ligaseligation buffer2×MasterMix,实验时,只需加入片段和载体即可进行连接反应。

    适用于DNA片段和载体DNA的连接以及DNA片段和LinkerAdaptor DNA的连接。

    注意事项

    12×ligation solution MasterMix由于含有T4 DNA ligase,使用前冰浴中彻底融化,混匀后使用。

    2.为了提高转化效率,转化时建议所加入连接产物的量不要超过感受态细胞体积的10%

    使用方法:

    DNA片段和载体DNA的连接

    1粘性末端的连接

    1.反应体系:

     

    10μl体系

    终浓度

    线性载体DNA

    x μl

    10-50 ng

    插入DNA片段

    y μl

    插入片段:载体=1:1-5:1*

    2×ligation solution MasterMix

    5 μl

    ddH2O

    up to 10 μl

     

    *:载体与插入片段的摩尔数比需要优化:一般vector:insert1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数:pmol= DNA(ng)/(660×片段bp)×1000。例如:插入片段2000bp,线性载体为3000bp,如果载体使用量为50ng0.025pmol),10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3,则需要2000bp pmol数为0.075pmol,插入片段2000bp的使用量为100ng

    2.彻底轻柔混匀后,瞬间离心,将管壁上的溶液收集到管底。

    3.反应条件:16孵育30分钟。

    4.可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。

    注:1)若要提高电转实验效率,推荐65孵育10分钟或70孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后,用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后进行电击转化。

    2)若要提高转化子数目,可将连接时间延长至1小时。

    2平末端的连接

    1.反应体系:

     

    10μl体系

    终浓度

    线性平末端载体DNA*

    x μl

    10-50 ng

    插入DNA片段

    y μl

    插入片段:载体=1:1-5:1**

    2×ligation solution MasterMix

    5 μl

    ddH2O

    up to 10 μl

     

    *:平滑末端的载体与 DNA 片段进行连接时,应首先将载体进行去磷酸化处理,以防止其自身环化。

    **:载体与插入片段的摩尔数比需要优化:一般vector:insert1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数:pmol= DNA(ng)/(660×片段bp)×1000。例如:插入片段2000bp,线性载体为3000bp,如果载体使用量为50ng0.025pmol),10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3,则需要2000bp pmol数为0.075pmol,插入片段2000bp的使用量为100ng

    2.彻底轻柔混匀后,瞬间离心,将管壁上的溶液收集到管底。

    3.反应条件:16孵育30分钟。

    4.可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。

    注:1)若要提高电转实验效率,推荐65孵育10分钟或70孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后,用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。

    2)若要提高转化子数目,可将连接时间延长至1小时。

    线性DNA的自身环化

    1.反应体系:

     

    10μl体系

    终浓度

    线性载体DNA

    x μl

    10-50 ng

    2×ligation solution MasterMix

    5 μl

    ddH2O

    up to 10 μl

     

    2.彻底轻柔混匀后,瞬间离心,将管壁上的溶液收集到管底。

    3.反应条件:16孵育30分钟。

    4.可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。

    注:1)若要提高电转实验效率,推荐65孵育10分钟或70孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase后,用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。

    接头连接


    1.反应体系:

     

    10μl体系

    终浓度

    线性DNA

    x μl

    100-300 ng

    磷酸化接头

    y μl

    0.5-1 μg

    2×ligation solution MasterMix

    5 μl

    ddH2O

    up to 10 μl

     

    2.彻底轻柔混匀后,瞬间离心,将管壁上的溶液收集到管底。

    3.反应条件:16℃孵育30分钟。

    4.65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase。连接产物可以直接进行限制性内切酶酶切反应。



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