pfu DNA Polymerase
高保真平末端DNA聚合酶
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目录号
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包装
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贮存
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RTH3102-02
RTH3102-03
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100U
5×100U
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-20℃
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● 贮存
-20℃保存一年。
● 产品简介
pfu DNA Polymerase是嗜热古细菌来源的DNA聚合酶，该酶除具有5’-3’DNA聚合酶活性外，还具有很强的3’-5’外切酶活性，增强了PCR扩增的保真度。与Taq酶相比，pfu聚合酶热稳定性更好，更能忍耐较高的变性温度。Pfu的保真性是Taq
DNA聚合酶的10-15倍。延伸速度为0.5kb/分钟。PCR产物3’端不带碱基A，为平滑末端，要通过平滑末端克隆法进行克隆。
● 产品组成（RTH3102-02）
pfu DNA
Polymerase（2.5U/μl） 40μl
10×pfu
PCR buffer（含Mg2＋） 0.5 ml
● 活性定义
1单位(U) pfu DNA Polymerase活力定义为在74℃、30分钟内，以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸不溶物质所需的酶量。
● 酶贮存缓冲液
50 mM Tris-HCl (pH 8.0);0.1 mMEDTA;1 mMDTT;50 mMKCl ; Stabilizers; 50% glycerol
● 适用范围
高保真的DNA片段的扩增、DNA片段的平滑化。
● 使用说明：
1. 按照下表在0.2ml PCR管中制备反应体系：
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成分
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20μl反应体系
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50μl反应体系
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终浓度
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Template
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0.04-0.2 μg
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0.1-0.5 μg
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as you wish
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Primer 1（10 μM）
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0.4 μl
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1 μl
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0.2 μM
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Primer 2（10μM）
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0.4 μl
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1 μl
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0.2 μM
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10×pfu PCR buffer(含Mg2+)
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2 μl
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5 μl
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1×
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dNTP Mixture(10 mM)
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0.4 μl
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1 μl
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200 μM each
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pfu (2.5 U/μl)
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0.4 μl
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1 μl
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0.05U/μl
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ddH2O
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up to 20 μl
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up to 50 μl
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-
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注1：如果需要改变Mg2+浓度，根据下表调节
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PCR反应体系中Mg2+终浓度
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2 mM
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2.5 mM
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3 mM
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4 mM
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20μl反应体系中25 mM MgSO4加入量
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0 μl
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0.4 μl
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0.8 μl
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1.6 μl
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50μl反应体系中25 mM MgSO4加入量
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0 μl
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1 μl
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2 μl
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4 μl
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注2：配制反应液时，请最后加入pfu，因为本酶有很强的3’-5’外切酶活性，有可能降解引物。
2. 混匀后，离心快甩将反应液收集到管底。
3. PCR仪如果没有热盖加热的话，补加25μl矿物油。
4. PCR仪上执行以下程序：
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步骤
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温度
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时间
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循环数
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初始变性
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94℃
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3-5 min
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1
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变性
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94℃
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30 sec
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25-40*
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退火
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50-60℃*
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30 sec
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延伸
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72℃
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0.5kb/min*
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最后延伸
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72℃
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5 min
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1
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*注： PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异。在实际操作中需根据模板、目的片段的大小、碱基序列和引物的长短等具体情况，设定最佳的反应条件（温度、时间等）。
● 注意事项
1. pfu 酶具有 3’-5’的外切酶活性，所以 pfu 酶扩增时延伸速度远比 Taq 酶低，应根据扩增产物的长度设置相应的延伸时间，一般情况下 pfu 酶的延伸速度为每分钟 0.5kb；同时 pfu 酶的 3’-5’的外切酶活性可能降解引物，所以应最后把pfu 酶到反应体系中，并立即进行 PCR 反应。
2. pfu 酶的热稳定性比 Taq 酶好，对于 GC 含量很高的模板，变性温度可以提高到98℃，对 pfu 酶的活性无影响。
● 使用举例：
水稻基因组做模板