单链DNA Marker（20-75 nt）预混型

单链DNA Marker由不同长度的单链DNA分子混合而成，7条带的大小为20，25，30，35，40， 50，75 nt。35 nt 浓度约为100 ng/μl，其余条带浓度约为50 ng/μl。该产品已经含有上样缓冲液，使用前70度处理5分钟后可以直接上样。该Marker适用于跑尿素变性胶，电泳后使用单链DNA PAGE电泳染色试剂盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE电泳染色试剂盒（Cat：RTS5102），核酸快速高灵敏度染色试剂盒（Cat：RTS5101）或核酸染料如RealSafe Red（货号：GR002）或RealSafe All（货号：GR004）均可以得到清晰的条带分离效果。

产品内附带2×TBE尿素上样缓冲液（Cat：DL080-01），方便待检样品的上样。以每次上样5 μl计算，该产品可以使用大约25次。

● 保存条件和运输：

-20℃贮存；有效期2年；湿冰运输。

● 使用方法：

注：以下使用方法均以8×10cm凝胶厚1.0mm示例，其他规格凝胶请适当调整。

一. 凝胶制备：

1.1 可以选择DNA尿素PAGE电泳试剂盒（Cat：RTE4102））或按照以下程序制胶：

表一 TBE-尿素PAGE分离胶配方表 (总体积5 ml，适用于厚度1.0 mm小板胶)

单链DNA长度	最佳凝胶浓度	尿素（克）	40%PAA （29:1）	10×TBE	补水到总体积	10%APS	TEMED
200-1000 nt	5%	2.1克	0.625 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
50-400 nt	8%	2.1克	1 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
30-300 nt	10%	2.1克	1.25 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
10-150 nt	15%	2.1克	1.875 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
5-120 nt	20%	2.1克	2.5 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl

1.2在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5 cm的水层，使凝胶表面保持平整。

1.3静置10-20分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

1.4去除覆盖在分离胶上的水层；按照表二将不同体积成分在一个小烧杯中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

表二 TBE-尿素PAGE 4%浓缩配方表 (总体积2 ml，适用于1.0mm厚度胶)

	各组份体积（ml）
凝胶浓度	尿素	40%PAA（29:1）	10×TBE	灭菌水	10%APS	TEMED
4%	0.84克	0.2 ml	0.2 ml	补水至体积2 ml	20 μl	2 μl

1.5将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

1.6静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

二. 样品制备：

2.1 取适量体积单链DNA Marker样品（不用添加上样缓冲液）；待测样品与等体积的2×TBE尿素上样缓冲液（Cat：DL080-01）混合，70℃处理5分钟，冰浴制冷后待上样。

三.电泳：

3.1. 预电泳（可选）：电泳槽内外加入适量1×TBE缓冲液稳压200V预电泳30分钟。电泳结束后，用1×TBE缓冲液彻底冲洗加样孔2-3次，去除残余的尿素。

3.2.上样：根据梳齿确定Marker上样量，一般是10齿1mm厚梳子上样5 μl，15齿1mm厚梳子上样3 μl。

3.3. 连接电源线，打开电源开关，按照以下条件电泳。

	恒电压	起始电流	结束电流	电泳时间	适用条件
推荐电压	200 V	15-20 mA/板胶	10-15 mA/板胶	60+ min	最佳电压，最优的分辨率

3.4. 等待上样缓冲液的溴酚蓝指示前沿到凝胶底部时终止电泳，取出凝胶进行后续实验。

变性胶浓度	溴酚蓝	二甲苯菁
5%	35 nt	130 nt
8%	19 nt	75 nt
10%	15 nt	55 nt
15%	10 nt	52 nt
20%	8 nt	35 nt

四．染色：

用单链DNA PAGE电泳染色试剂盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE电泳染色试剂盒（Cat：RTS5102）或核酸快速高灵敏度染色试剂盒（Cat：RTS5101）染色均可以得到清晰的条带分离效果。注：如果使用核酸染料染色，RealSafe Red（货号：GR002）或RealSafe All（货号：GR004）核酸染料结合单链核酸效果最佳，强烈建议使用以便获得最佳效果的胶图。其余染料如GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。

● 注意事项：

1. 单链DNA Marker产品适用于变性PAGE垂直电泳，不适用于水平琼脂糖凝胶电泳。

● 电泳示例：

1. 使用单链DNA PAGE电泳染色试剂盒（货号：RTS5103）染色：