Western一抗二抗去除液（强碱，剧烈型）

● 产品简介：

Western一抗二抗去除液（强碱，剧烈型）(Western Antibody Stripping Buffer，basic，harsh type)可以高效去除印迹膜上的一抗和二抗，而吸附在膜上的抗原基本不受影响，用于Western中转移了蛋白膜的重复利用，可以转一次膜，做多次Western印迹实验，通常可以重复利用膜3-5（PVDF膜）。使用本试剂只需大约5-10分钟（NC膜）或15-20分钟（PVDF膜）即可实现蛋白膜的重复使用，然后可以进行Western的后续操作。

该产品具有以下几个优点：

1.可用于昂贵或珍稀样本的多次杂交；

2.有利于用不同抗体分析单次印迹上的不同蛋白，比如不同亚型的抗体；

3.有利于对异常结果进行重新分析或确认；

4.有利于纠正孵错的抗体；

5.节约试剂成本，并节约时间。

各种去除液的选择请点击Western一抗二抗去除液选择指南。

● 贮存：

   常温贮存，有效期一年；常温运输。

● 用前必读：

1. 理想的抗体去除液应该是洗脱抗体的同时，不洗脱膜上结合的蛋白或者不改变抗原的结合性质，但是目前没有一种去除液可以做到只洗脱抗体，而完全不洗脱膜上结合的抗原；也没有一种去除液可以适用于所有不同亲和度的抗原抗体复合物。去除液洗脱能力太强，抗原也容易被洗脱；太弱，则抗体残留太高。因此，从免疫印迹膜上去除抗体的方案仅能用于定性用途，因为在每个抗体清除循环中，或多或少都将洗去少量膜上的蛋白。

2. PVDF膜比硝酸纤维素膜（NC膜）更坚韧，因此优先推荐使用PVDF膜用于涉及抗体剥离的实验。

3. 从SDS-PAGE凝胶转印完成后立即干燥PVDF膜或NC膜，可改善蛋白质与膜的结合，特别推荐用于涉及多次抗体剥离的实验。在第一轮抗体检测之前，必须使用甲醇将干燥的PVDF膜润湿或用1×TBST将干燥的NC膜润湿。已经结合有抗体的膜，决不能使得膜干燥，否则抗体分子将与膜结合紧密，很难剥离。因此，在做完一轮ECL发光检测实验后，需要用清除液清除掉膜上的抗体，推荐将膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。

4. 检测时，优先检测低丰度抗原：先孵育条带较弱（表达较低）的蛋白，再孵育条带明显（表达较高）的蛋白，最后再孵育内参。

5. 如条件允许，下一轮的抗体杂交实验选择种属来源不同的一抗（对应不同种属的二抗），减少检测的交叉反应。

6. 该清除液适用于ECL发光检测的膜上抗体清除，不适合于膜上直接显色（DAB，BCIP/NBT等），不适合荧光检测。

● 使用说明：

1. 在完成Western化学发光检测后，NC膜或PVDF膜用适量蒸馏水中震荡漂洗5分钟；重复漂洗2次。

2. 弃蒸馏水，加入适量的Western一抗二抗去除液，在摇床上震荡漂洗清除抗体。

孵育温度和时间会明显影响抗体去除效果，参照下表调整。

3. 弃去除液，加入足量蒸馏水，在摇床上漂洗2次，每次5分钟，把去除液彻底漂洗干净。

  注：残余的去除液会影响后续抗原抗体的的结合。

4. 可选步骤：漂洗后的转印膜孵育ECL发光液，检测二抗的清除效率。曝光5分钟，膜上看不到发光条带表明二抗清除得比较干净。如果膜上能看到条带，重复步骤2-3。

5．继续进行Western的后续操作（封闭-抗体孵育-发光检测）。

   注：建议每次膜剥离后都要进行重新封闭，以降低背景。优先选用5%脱脂奶粉（货号：WN1070）封闭，推荐常温封闭1小时；使用Western无蛋白快速封闭液（货号：PF1070）时，NC膜需要封闭60分钟；PVDF膜可以封闭10分钟。

● 实验示例：

Western一抗二抗去除液（碱性，剧烈型）检测效果图

Western一抗二抗清除液（碱性，剧烈型）检测效果图

样品：K562细胞，SDS裂解液（货号：RL1060）提取总蛋白；

电泳：4-20% RealPAGE预制胶（货号:RTD6117-0420）， 200 V 1×TGS  56 min

转膜：NC膜，1×RealBlot快速转膜液（货号：RT5020）400 mA 40 min

图1：5%脱脂奶粉封闭液（货号：WN1070）  RT  60 min；一抗：Santa β-Actin鼠单抗（SC-47778） 1:2000  RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000（货号：HGM1060）  RT 60min；ECL自动曝光3秒

图2：膜加入Western一抗二抗清除液（碱性，剧烈型），第1次清除，常温25度，摇床5 min，ECL自动曝光5分钟，膜上二抗条带去除干净。

图3：5%脱脂奶粉封闭液（货号：WN1070），常温摇床60分钟，PCNA 1:5000（货号：APM5012）  RT 60min，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000 （货号：HGM1060）RT 60min，自动曝光11秒，β-actin和PCNA同时有条带，说明图二中actin一抗没有完全去除干净。

图4：膜加入Western一抗二抗清除液（碱性，剧烈型），常温24度 5 min第2次清除抗体，

Western无蛋白快速封闭液（货号；PF1070）RT 60分钟，一抗：Santa β-Actin鼠单抗（SC-47778） 1:4000 RT 60min，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000（货号：HGM1060）  RT 60min；ECL自动曝光6秒。

图5：膜加入Western一抗二抗清除液（碱性，剧烈型）第3次清除 26度 5min，

一抗：Santa β-Actin鼠单抗（SC-47778） 1:4000  RT 60min；

二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000（货号：HGM1060）  RT 60min；ECL自动曝光3分钟。