15% TBE-尿素-PAGE制胶液（核酸变性电泳）
|
货号
|
名称
|
规格
|
|
RTE4104-15
|
15% TBE-尿素-PAGE制胶液(核酸变性电泳)
|
200 ml
|
● 产品组成：
|
序号
|
货号
|
名称
|
规格
|
保存条件
|
|
1
|
RTE4104-15-1
|
15% TBE-尿素-PAGE制胶液
|
200 ml
|
4℃
|
|
2
|
AP020P
|
APS（干粉）
|
5 ml
|
RT (配制后-20℃贮存)
|
|
3
|
TA0761-01
|
TEMED
|
0.5 ml
|
4℃，避光
|
|
4
|
|
说明书
|
一份
|
|
● 产品简介：
核酸尿素 PAGE 电泳是研究寡核苷酸和小RNA电泳的重要研究手段。可以检测2-500碱基的寡核苷酸或RNA片段，理论上可以分辨出相差一个核苷酸的片段。
本公司提供的TBE-尿素-PAGE制胶液为一瓶即用型试剂，包含尿素，凝胶聚合溶液和TBE缓冲液，使用时只需取适量制胶液，随后加入催化剂即可配制成固定浓度的TBE-尿素-PAGE凝胶，使用方便。
根据下表选择合适的凝胶浓度：
|
推荐分离范围 nt
|
TBE-尿素-PAGE浓度
|
溴酚蓝
|
二甲苯菁
|
|
200-1000
|
5%
|
~35 nt
|
~130 nt
|
|
50-400
|
8%
|
~19 nt
|
~75 nt
|
|
40-350
|
10%
|
~15 nt
|
~55 nt
|
|
30-300
|
12%
|
~12 nt
|
~55 nt
|
|
10-150
|
15%
|
~10 nt
|
~52 nt
|
|
8-120
|
20%
|
~5 nt
|
~50 nt
|
按照每次制备7 ml 凝胶（大小10×8cm，1mm厚度）计算，该制胶液可以至少制备25块15%TBE-尿素-PAGE凝胶。
如果进行RNA电泳实验，建议使用RNase-free水配制相关溶液，避免RNA的降解。
● 贮存和运输：
按照标签温度贮存；有效期6个月；试剂盒常温运输。
● 使用说明：
一、制备凝胶：
10% APS配制-5 ml：
将0.5 gAPS干粉溶于5 ml 灭菌水或RNase-free水中，彻底溶解后分装，1 ml/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少常温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10% APS。
1.1．参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
1.2．凝胶配制：将不同体积的成分混合。
|
|
15%TBE-尿素-PAGE凝胶
|
|
|
总体积7 ml，适用于厚度1.0 mm小板胶
|
|
15% TBE-尿素-PAGE制胶液
|
7 ml
|
|
10%APS
|
50-70 μl
|
|
TEMED
|
5-7μl
|
1.3将配制好的胶液加入到玻璃板中，在胶的液面到达顶部时停止灌胶，插入梳子。
1.4 静置25-40 分钟。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。凝胶25℃ 20-25分钟可以聚合；18℃ 35-40分钟可以聚合。
二、电泳：
2.1. 预电泳（可选）：
拔出梳子，用1×TBE缓冲液彻底冲洗加样孔2-3次，去除残余的尿素。电泳槽内外加入适量1×TBE缓冲液稳压200 V预电泳30分钟。
注：1×TBE配方如下：
|
终浓度
|
顺序
|
原料
|
1升
|
5 升
|
|
89
mM
|
1
|
Tris碱 [MW121.14]
|
10.8 克
|
54克
|
|
2
mM
|
2
|
EDTA
2Na·2H2O [MW372.24]
|
0.744 克
|
3.72克
|
|
89
MM
|
3
|
硼酸 [MW61.83]
|
5.5 克
|
27.5克
|
|
|
4
|
蒸馏水或RNase-free水最后定容至
|
1 升
|
5 升
|
|
|
|
最后pH在8.2-8.3之间，可以不用调节pH，记录每批pH
|
2.2. 取 3-5
μl样品，加入等体积2×TBE尿素上样缓冲液（货号：DL080），70℃处理5分钟后立即冰浴，上样。
2.3. 连接电源线，打开电源开关，按照以下条件电泳。
|
|
恒电压
|
起始电流
|
结束电流
|
电泳时间
|
适用条件
|
|
推荐电压
|
200V
|
15-20
mA/板胶
|
8-15
mA/板胶
|
50+
min
|
最佳电压，最优的分辨率
|
2.4. 根据下表溴酚蓝指示前沿位置判断条带位置，取出凝胶进行后续实验。
|
变性胶浓度
|
溴酚蓝
|
二甲苯菁
|
|
5%
|
~35 nt
|
~130 nt
|
|
8%
|
~19 nt
|
~75 nt
|
|
10%
|
~15 nt
|
~55 nt
|
|
12%
|
~12 nt
|
~55 nt
|
|
15%
|
~10 nt
|
~52 nt
|
|
20%
|
~5 nt
|
~50 nt
|
三、染色（RealSafe核酸染料染色）：
3.1染色液配制：取一合适的塑料容器，加入100 ml 1×TBE，随后加入10 μl RealSafe核酸染料（货号：GR002）混匀。
3.2 染色：取下凝胶放入染色液中，常温下摇床轻轻地摇动凝胶染色，最佳的染胶时间为15-20 分钟，这取决于凝胶的厚度、聚丙烯酰胺的浓度和核酸的长短。凝胶越厚或聚丙烯酰胺的浓度越高，染色所需要的时间就越长。注：染色溶液至少可重复使用2-3次。如果不立即再用的话，建议将用过的染色溶液冷藏避光保存。
3.3 观察：紫外灯下观察条带。
● 实验示例：